絲素蛋白抗菌性修飾在皮膚組織工程中的應用

崔雅婷，馬保金，葛少華

機械創傷、燒傷或慢性炎癥等損害造成的皮膚缺損可導致皮膚組織直接暴露于環境中，使其易受到細菌的侵襲，因此在治療時控制感染對于提高治療修復效率具有重要的意義。自體皮膚移植雖是臨床上治療皮膚缺損的有效方法，但存在供體皮膚不足、二次創傷等問題；而異體皮膚移植往往存在免疫排斥反應等問題。皮膚組織工程為皮膚修復再生提供了新思路，其中支架材料在皮膚的再生中起著關鍵作用。支架材料可分為天然生物材料、人工合成材料和復合材料[1]。在眾多的天然生物支架材料中，絲素蛋白(silk fibroin，SF)是最受關注和歡迎的。優良的生物相容性、出色的機械性能、可降解性、無毒無刺激性等優勢使SF被廣泛應用于皮膚創面的修復中[2]。然而，SF本身不具備抗菌性能，在修復過程中傷口容易感染，導致修復效率較低甚至失敗。因此，通過修飾賦予SF抗菌性能，對于促進SF在皮膚組織工程中的應用具有重要意義。

1 SF的結構與理化性質

1.1 SF的結構

SF是蠶絲通過脫膠提取得到的天然高分子纖維蛋白，其含量約占蠶絲的70%～80%。SF由一條重鏈(H鏈)和一條輕鏈(L鏈)組成，雙鏈通過二硫鍵連接在一起組成重鏈輕鏈H-L復合體[3]。SF主要晶體結構是silk Ⅰ和silk Ⅱ。silk Ⅰ是具有曲柄或S形結構空間構象的亞穩態結構；silk Ⅱ是反向平行的β-折疊結構，相鄰鏈段之間的氫鍵極大地增強了SF的剛度和拉伸強度[3-5]。甲醇處理后，silk Ⅰ可以轉變為silk Ⅱ的β-折疊結構[6]。

1.2 SF的理化性質

蠶絲通過脫膠去除具有免疫原性的絲膠蛋白后，保留的SF顯示出優良的生物相容性。SF來源于生物體，具有與細胞外基質相似的結構，在非桑蠶(例如柞蠶絲)SF中具有的Arg-Gly-Asp(RGD)結構還能夠促進細胞的粘附和增殖[7]。有研究發現加入SF的支架材料具有更優的孔隙率以及規則連續的結構，有利于細胞的粘附和生長[8]。此外，SF可激活經典的NF-κB信號通路來促進傷口愈合[9]，同時還可促進成纖維細胞的增殖和遷移并合成膠原蛋白[10-11]。

SF還具有良好的機械性能，使其滿足創面修復的需求。SF的拉伸強度可達610～690 MPa，韌性達70～78 MJ/m3，相較于其他材料，SF具有很好的強度和韌性，并且在剛度方面優于常用的聚合物材料(如膠原蛋白和聚乳酸)[12]。SF具備的高拉伸強度使其能夠適應傷口愈合過程中的收縮以及周圍皮膚在日常運動中的牽拉，在保持材料的機械完整性上，發揮創面的保護作用。

SF具有可降解性，但其降解吸收周期較長，降解速率與silk Ⅱ晶體結構的含量、親水作用以及特殊的晶體-非晶體交替納米結構有關[13]。理想的生物支架材料應具有與組織修復相匹配的降解速率，通過對SF降解速率的調控，可以制備出更加適合于皮膚創傷修復的傷口敷料，同時SF的降解產物與人體皮膚具有較強的親和力，易于吸收，有助于對皮膚創面的修復。

2 SF的抗菌性修飾

通過不同的抗菌性修飾，SF可以有效抗菌，提高皮膚組織的修復效率。目前修飾SF的抗菌劑主要分為無機抗菌劑、有機抗菌劑以及其他類型抗菌劑。

2.1 無機抗菌劑

修飾SF的無機抗菌劑主要包括金屬(如Ag、Zn、Ti等)及其氧化物(如TiO2、ZnO等)。無機抗菌劑主要通過釋放金屬離子以及產生高水平活性氧(reactive oxygen species，ROS)來發揮抗菌作用[14]。

近年來納米銀(Ag nanoparticles，AgNPs)抗菌劑受到廣泛關注。具有還原性的SF能夠原位還原硝酸銀生成AgNPs[15]，這種原位綠色還原方式可減少額外材料的加入，提高合成材料的生物相容性，同時生成的AgNPs能有效抑制大腸桿菌的生長。Zhang等[16]通過給蠶幼蟲喂食由葡萄糖包被的AgNPs，可獲得具有抗菌性能的蠶絲，研究結果顯示，低濃度0.02%和中等濃度0.20%AgNPs喂養幼蟲所產生的絲纖維不但具有抗菌特性，而且其伸長率和拉伸強度顯著增加，這為未來直接獲得具備抗菌性能的SF提供了新方向。Ag具有強效、廣譜抗菌性，且不易產生耐藥性，但其具有的細胞毒性不容忽視[17-18]。目前，有研究利用外泌體修飾AgNPs，通過形成蛋白質保護降低AgNPs對細胞的毒性作用[19]。

有學者采用靜電紡絲技術將不同濃度的ZnO摻入透明質酸(hyaluronic acid，HA)-SF納米纖維中，制備出具有核-殼結構的復合納米纖維，隨ZnO濃度的增加，納米纖維的抗菌活性顯著增強[20]。此外，通過冷凍干燥法制備出負載納米二氧化鈦(TiO2nanoparticles，TiO2NPs)的SF抗菌敷料，對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌性，其中敷料對白色念珠菌的抑菌能力最強，對金黃色葡萄球菌的最弱，這可能是由于與革蘭陰性菌相比，革蘭陽性菌細胞壁中的肽聚糖較厚，阻止了TiO2NPs的滲透[21]。

2.2 有機抗菌劑

有機抗菌劑主要是通過化學基團與菌體胞膜相互作用有效抗菌。根據來源不同，有機抗菌劑可分為天然有機抗菌劑和人工合成有機抗菌劑。

2.2.1 天然有機抗菌劑 天然有機抗菌劑具有高生物相容性，在應用過程中安全性更高。與SF結合的天然有機抗菌劑主要有殼聚糖(chitosan，CTS或CS)、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、溶菌酶(lysozyme，LY)等。

CS是一種帶正電荷的天然堿性多糖，在酸性環境中，氨基通過質子化使CS成為陽離子多糖，其帶有的正電荷能夠與微生物細胞膜表面的負電荷相互作用，通過改變微生物細胞膜的通透性殺死微生物[22]。CS與SF的結合多是采用冷凍干燥[23]、靜電紡絲[24]和層層自組裝(layer-by-layer self-assembly，LBL)等技術[25]，但CS的抗菌作用受其去乙?；潭?、分子量以及環境pH大小等影響[26]。納米CS具有高表面反應、低毒性、小尺寸等特點，可改善CS的性能，通過冷凍干燥法與SF混合后既能夠發揮抗菌作用，同時又能提升支架材料的力學性能[27]。羧甲基殼聚糖具有抗菌性、水溶性以及多個功能性化學基團，通過化學鍵、強氫鍵及聚合物構建的網絡結構與SF穩定地結合，可用于老化蠶絲的修復并起到抗真菌的作用[28]。

AMPs是一類來源于生物體的帶正電荷的多肽物質，其通過靜電作用與帶負電荷的細菌細胞膜結合，破壞胞膜的完整性[29]，產生抗菌活性。通過靜電紡絲技術將幽門螺桿菌核糖體蛋白A2(一種源自幽門螺桿菌的AMP)與SF相結合，得到一種具有高生物相容性和抗菌性的納米纖維。抑菌實驗結果顯示，復合納米纖維對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均表現出較強的抑制作用[30]。目前，AMPs的基因工程研究可以改善AMPs來源不足、無法大規模生產的缺點[31]，并且采用酵母為基因工程受體菌的研究引起了人們的重視[32]，這可能作為進一步研究AMPs修飾SF的切入點。

LY也是一種多肽物質，其抗菌原理是通過破壞細菌細胞壁中的β-(1,4)-糖苷鍵，導致細胞壁破裂、細菌溶解[33]。將LY和膠原蛋白通過LBL技術交替沉積在SF和尼龍6復合納米纖維墊上后發現，復合納米纖維墊能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長，但對革蘭陰性菌較不敏感[34]，可能因為革蘭陰性菌只有內壁層為肽聚糖，不易被LY破壞。

2.2.2 人工合成有機抗菌劑 與天然有機抗菌劑相比，人工合成有機抗菌劑最大的優勢在于其性質穩定，能夠高效抗菌。SF人工合成有機抗菌劑的修飾主要包括聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、聚(六亞甲基雙胍)鹽酸鹽(poly(hexamethylenebiguanide)hydrochloride，PHMB)等。

PEI是一種聚陽離子聚合物，其具有進入細胞或滲透細胞膜的能力，在生物醫學中作為藥物載體用于抗菌。通過靜電紡絲技術制備的PEI/SF傷口敷料具有良好的生物相容性以及抗菌性能[35]，但PEI對細胞的毒性會隨著分子量的增加、濃度的升高以及結構的變化而增強的。針對細胞毒性問題，有研究者利用D-甘露糖修飾PEI，使修飾后的PEI在10 μg/mL的濃度時就顯示出良好的殺菌效果，并且在該濃度下沒有顯示出明顯的細胞毒性[36]。

PHMB是一種陽離子低聚物的高效抗菌劑，PHMB可與細菌細胞質膜粘附，導致細菌細胞質中鉀離子和其他成分的外流，細菌細胞膜通透性屏障完全喪失，最終導致細菌死亡[37]。Liang等[38]通過靜電相互作用、氫鍵結合以及范德華力將帶正電荷的PHMB與帶負電荷的SF相結合，采用冷凍干燥技術制備出具有抗菌功能的多孔SF海綿。研究表明，PHMB/SF的抗菌作用隨PHMB含量的增加而增強，且對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用要優于大腸桿菌。

2.3 其他抗菌性修飾

除以上抗菌劑的修飾外，通過改善SF形狀與結構及應用離子電滲療法也能賦予SF支架材料抗菌特性。

對皮膚施加直接恒定的低密度電流稱為離子電滲療法，Lemos等[39]開發出一種含有神經緊張素的絲素膜，應用離子電滲療法來抑制細菌的生長，結果顯示當陽離子電滲療法應用于革蘭陽性菌時會有抑菌圈的形成。Tullii等[40]采用軟刻蝕的方法實現了具有不同幾何形狀的微米和納米結構的SF載體，研究顯示附著在經該載體修飾后的SF材料表面上的細菌數量最多減少了66%，同時將經微米和納米結構修飾后的SF薄膜與半導體聚合物相結合，發現防污性能也得到了很好的保留。

3 SF的抗菌性修飾在皮膚組織工程中的應用

燒傷、割傷、擦傷等造成的大面積缺損使皮膚直接暴露于環境中，往往會伴隨著復雜感染，開發具有良好抗菌活性的傷口敷料極為重要。已有研究通過以SF作為支架材料同時添加抗菌劑，制備出具有抗菌性的傷口敷料用于皮膚創傷的修復。

將外泌體修飾的AgNPs添加到CTS-SF/硬脂酸(stearic acid，SA)中，制備成CTS-SF/SA/Ag-Exo敷料。體外實驗結果顯示，細菌通過分泌磷脂酶來溶解外泌體導致AgNPs釋放，AgNPs破壞細菌細胞壁和蛋白質，最終導致微生物死亡。同時CTS-SF/SA/Ag-Exo敷料對多種致病菌均有很好的抑菌作用，在感染初期AgNPs的釋放能夠有效殺死細菌、控制炎癥，從而促進傷口的愈合[19]。

通過LBL技術將聚己內酯(polycaprolactone，PCL)/SF膜與第四代甲殼素(quaternized chitin，QC)/SF沉積形成PQCSF傷口敷料，研究發現PQCSF的抗菌性隨沉積層的增加而增強，并且對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長都有很好的抑制作用；另外QC的抗菌活性和SF促愈合的作用，可以協同加快傷口的愈合[41]。

Han等[42]制備的聚多巴胺納米顆粒(polydopamine nanoparticles，PDA NPs)貽貝型CS/SF冷凍凝膠，利用近紅外的光熱轉化協同CS的殺菌能力增強抗菌活性。PDA NPs通過吸收光能并轉化為熱能，使細菌中的酶和蛋白質變性從而溶解細菌。研究顯示在皮膚損傷后第21天，通過近紅外光照射的PDA NPs-CS/SF組中剩余傷口面積最小。

與身體其他部位相比，口腔頜面部皮膚直接暴露在外，缺乏衣物或防護服的保護，在外力作用下尤其在戰爭中更易受到損傷。爆炸和火器造成的軟組織損傷在頜面部創傷中占有較高的比例，損傷創面易被細菌和塵土等污染，導致傷口感染，增加損傷的復雜性和嚴重性。因此，開發具有抗感染、促愈合的傷口敷料用于口腔頜面部創傷的修復具有重要意義。有研究發現，具有非對稱潤濕改性的CTS-SF Ag/SA海綿敷料在親水側能夠緩慢釋放敷料中的AgNPs顆粒，有效殺滅細菌，加速感染傷口的愈合；在疏水側能夠減少敷料內部水分喪失，隔絕空氣中的微生物，防止創面的二次感染，從而有利于傷口的愈合[43]。此外，有研究通過靜電紡絲技術制備出SF基質材料用于口腔黏膜創面的修復，實驗結果表明SF基質具有較好的創面愈合能力，能夠改善創面疤痕組織的形成以及表皮的生長[44]。然而具有抗菌性修飾的SF對于口腔黏膜創面的修復未見報道。口腔內存在多種細菌，仍存在創面感染的風險。因此，SF的抗菌性修飾對口腔黏膜創面的修復可能成為未來研究的新方向。

4 小 結

SF優良的生物相容性、促愈合性、可降解性以及出色的機械性能，使其作為傷口敷料可以廣泛應用于修復受損創面。通過進行抗菌性修飾可以使SF有效地控制傷口感染。目前針對無機抗菌劑、人工合成有機抗菌劑的細胞毒性問題及天然有機抗菌劑的穩定性、來源等問題已經得到相應的研究和改善，這為開發具有更安全、更高效抗菌性能的SF支架材料提供了新思路。在皮膚組織工程的應用中，SF能夠協同促進傷口的愈合，但相關研究局限于體外實驗和體內動物模型，仍需進一步的臨床試驗加以驗證。