小麥矮稈基因 Rht-B1b和 Rht-D1b的檢測及其驗證

劉 娟，張 凱，范勝男，韓 洋，馮玉梅，李星巖，韓 冰，楊 燕

(內蒙古農業大學生命科學學院植物生物技術功能實驗室/內蒙古自治區植物逆境生理與分子生物學重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018)

小麥作為全球主要的糧食作物之一[1]，隨著全球人口數量不斷增加、氣候不斷惡化以及旱澇等自然災害頻發，使得小麥產量大幅度下降。因此，高產成為小麥育種的主要目標之一。株高作為谷類作物的重要農藝性狀，對作物產量潛力和穩定性具有重要影響。研究表明，降低株高可提高植物的抗倒伏性[2-3]。

上世紀60年代，矮稈基因首次應用到小麥育種中，引發了第一次“綠色革命”[4]，在小麥育種實踐中利用的矮稈基因大體可分為三類：草叢型矮生基因(D)、單莖矮生基因(Us)[5-6]和降低株高的主效矮稈基因(Rht)。截止目前，已發現的小麥Rht矮稈基因共有25個，每個Rht基因對小麥株高產生的影響不同。其中，在小麥的矮化育種中，使用最廣泛的矮稈基因是來自于農林10號的Rht-B1b(Rht1基因突變型)、Rht-D1b(Rht2基因突變型)和來自于日本赤小麥(Akakomugi)的Rht8[7-8]。Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8為隱性基因，分別位于小麥4B、4D和2D染色體上。研究發現，Rht-B1b和Rht-D1b基因單獨存在時，降稈效應約24%，Rht-B1b和Rht-D1b同時存在時，會產生累加作用，降稈效應近60%[9-10]。而Rht8降稈效應為11%[11]，相較于Rht-B1b和Rht-D1b，降稈能力較弱[12]。

分子標記的應用，使得更多的基因被準確定位，Ellis等[13]設計的STS分子標記可以準確地鑒定出Rht-B1b和Rht-D1b基因。本研究利用Ellis等[13]設計的STS分子標記引物對321份中國小麥材料Rht-B1b和Rht-D1b基因的分布情況進行檢測，此外，對91份春小麥育種材料(具有株高表型數據)中Rht-B1b、Rht-D1b以及Rht-B1b+Rht-D1b的分布及各單倍型對小麥株高的影響進行分析，以期篩選出優良的矮稈基因資源，為合理利用小麥資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料包括321份小麥材料，其中，中國冬麥區白粒小麥品種84份，中國小麥歷史品種106份，春小麥育種材料131份，均由本實驗室收集和保存。并選取91份春小麥育種材料(具有株高表型數據)進行春小麥自然群體的株高鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥基因組DNA提取

利用CTAB法[14]提取321份小麥幼嫩葉片的基因組DNA，利用紫外分光光度計檢測DNA濃度，并將終濃度調至50 ng·μL-1，存于-20 ℃備用。

1.2.2 矮稈基因的分子標記檢測

根據Ellis等[13]發表的序列設計引物，引物對BF/WR1用于擴增Rht-B1a基因(Rht1基因野生型)，引物對BF/MR1用于擴增Rht-B1b基因(Rht1基因突變型)；引物對DF2/WR2用于擴增Rht-D1a(Rht2基因野生型)，引物對DF1/MR2用于擴增Rht-D1b(Rht2基因突變型)，分別以小偃 6 號(含有Rht-B1b基因)[15]和新麥18(含有Rht-D1b基因)[16]為陽性對照，驗證PCR反應和電泳結果的準確性。上述引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，具體序列信息見表1。

PCR反應體系為15 μL，包括模板DNA 1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 6.2 μL，引物(濃度為0.25 nmol·μL-1)各0.15 μL，滅菌雙蒸水補充至15 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性 5 min，94 ℃變性30 s，退火溫度見表1，時間為 30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用Gold View核酸染料染色，緩沖體系為1×TAE溶液，100 V電壓下電泳20 min，在凝膠成像儀下觀察并照相。

表1 擴增矮稈基因所用的特異引物Table 1 Specific primers for amplification of dwarfing genes

1.2.3 91份春小麥育種材料株高的測定

2015和2016年分別將91份春小麥育種材料播種于內蒙古呼和浩特市，采用隨機區組設計，行長2 m，株距15 cm，行距20 cm，設置2個重復，在相同外界條件下進行培養，小麥進入成熟期后，每一株系隨機選取10個單株進行株高測量，統計每份材料兩年的平均株高數據，求均值。

2 結果與分析

2.1 Rht-B1基因位點等位變異的分布頻率

利用兩對引物BF/MR1和BF/WR1對供試材料Rht-B1基因位點進行PCR檢測，結果(圖1，表2～4)顯示，在321份材料中，中國春、河套3號等66份材料含有矮稈基因Rht-B1a，占總數的20.1%；82170-1、臨優一號等193份小麥品種含有矮稈基因Rht-B1b，占總數的 60.1%；巴豐5號、蘭天25號等62份材料不含所檢測矮稈基因，占總數的19.3%。

在84份中國冬麥區白粒小麥品種中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有30、29和25份，占比分別為35.7%、34.5%和29.8%。在106份歷史小麥品種中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所檢測矮稈基因材料分別有8、77和21份，占比分別為7.6%、72.6%和19.8%。在131份春小麥育種材料中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有28、87和16份，占比分別為 21.4%、66.4%和12.2%。

2.2 Rht-D1基因位點等位變異的分布頻率

對供試小麥品種Rht-D1基因位點進行PCR檢測，結果(圖2，表2～4)顯示，321份材料中，永2352、臨農14等73份小麥品種含有矮稈基因Rht-D1a，占總數的22.7%；臨優一號、格蘭尼等135份小麥品種矮稈基因Rht-D1b，占總數的42.1%；沈太1號、陜農757等113份小麥品種均不含所檢測矮稈基因，占總數的35.2%。

表2 84份中國冬麥區白粒小麥品種矮稈基因的檢測Table 2 Detection result of dwarfing genes in 84 wheat cultivars in China winter wheat areas

+代表有該材料含有所檢測的矮稈基因；-代表該材料不含所檢測的矮稈基因。表3～4同。

+ means containing the dwarfing genes detected;-means not containing dwarfing genes detected.The same in tables 3-4.

表3 106份中國歷史小麥品種矮稈基因的檢測結果Table 3 Detection result of dwarfing genes in 106 historical wheat cultivars

表4 131份春小麥材料矮稈基因的檢測結果Table 4 Detection result of dwarfing genes in 131 spring wheat breeding materials

(續表4 Continued table 4)

在84份中國冬麥區白粒小麥品種中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有14、41和29份，占比分別為16.7%、48.8%和34.5%。在106份歷史小麥品種中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含Rht-D1a和Rht-D1b矮稈基因的材料分別有40、21和45份，占比分別為37.7%、19.8%和42.5%。在131份春小麥育種材料中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有19、73和39份，占比分別為14.5%、55.7%和29.8%。

2.3 不同基因型材料的株高結果

選取91份春小麥育種材料，對其株高及其相關基因進行分析，結果(表5)發現，含有Rht-B1b、Rht-D1b、Rht-B1b+Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因小麥材料的平均株高分別為 71.95、67.84、67.19和78.29 cm。多重比較結果(表5)表明，同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高最低，但與單獨含有Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高無顯著差異，而與單獨含有Rht-B1b矮稈基因和不含所檢測矮稈基因小麥材料的平均株高差異顯著，矮稈基因的分布及株高數據詳見表6。

表5 不同矮稈基因對91份春小麥育種材料株高的影響Table 5 Effect of different dwarfing genes on plant height of 91 Spring wheat breeding materials

表6 91份春小麥育種材料 Rht-B1b和 Rht-D1b的檢測結果及株高Table 6 Plant height and detection result of Rht-B1b and Rht-D1b in 91 Spring wheat breeding materials

(續表6 Continued table 6)

(續表6 Continued table 6)

3 討 論

本試驗利用Ellis等[13]發表的4對特異性分子標記，其準確性已經過楊松杰等[15]、慕美財等[17]和唐 娜等[18]的驗證，該標記多態性強且目的基因條帶清晰，可應用于小麥分子標記輔助育種試驗。小麥矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b為隱性基因，不宜于早代篩選, 但若利用分子標記輔助選擇可提前獲得含有矮稈基因的小麥個體，加快小麥矮化育種進程。本研究檢測的321份材料中，Rht-B1b矮稈基因的分布頻率高于Rht-D1b矮稈基因，這與梁 丹等[19]對263份CIMMYT材料的矮稈基因分子檢測結果一致。

本試驗對91份春小麥育種材料的株高進行相關分析，發現含有Rht-B1b、Rht-D1b、Rht-B1b+Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因小麥材料的平均株高分別為71.95、67.84、67.19和 78.29 cm，其中，單獨含有Rht-B1b、Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高與Miralles等[9]和Brner等[7]的研究結果基本一致；但在本研究中，雖然同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高最低，但可能由于本研究試驗材料品種數量的局限性，Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因同時存在時，降稈效應沒有達到60%，與前人[9-10]研究結果不一致，所以，后期還需要加大樣本量來驗證這一結果。

多重比較分析發現，同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高最低，這些小麥材料共有26份，分別為07-7165、青春556、05cm178、05cm220、07-5866、08冬中788、08冬中3008、交原356、05-1173、格蘭尼、08冬中1146、05-1411、07-6228、08冬中5378、蘭雜7002、08冬中1807、輪選、臨優一號、08-1312 、08冬中6741、07-6239、張掖1號、08-1826、08-3348、08-1699、08冬中2455。以上材料可在降低株高的抗倒伏育種中作為親本使用。