大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL初步定位分析

嚴苓方，楊曉夢，杜 娟，孫正海，普曉英，楊加珍，曾亞文

(1.云南省面向南亞東南亞經濟林全產業鏈聯合研發中心/云南省高效經濟林培育示范型國際科技合作基地/西南林業大學園林園藝學院，云南昆明 650224； 2.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室，云南昆明 650205； 3.農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南昆明 650205)

大麥(HordeumvulgareL.) 是世界上最早被馴化的谷類栽培作物之一[1]，不僅是糧食作物、經濟作物和飼料作物，還是藥食同源作物[2]，對預防和治療糖尿病、高血壓、心血管疾病、慢性尿毒癥等慢性疾病有特殊功效和巨大的藥用價值[3]。因此，大麥的功能成分是當前大麥的研究熱點之一。

大麥籽粒中含有豐富的必需氨基酸。其中，苯丙氨酸是人體八大必需氨基酸之一，但人和動物自身無法合成[4]。現已明確大麥籽粒氨基酸含量為數量性狀，受基因型和環境共同影響[5]。農藝措施、氣象因素及地域條件等均會影響大麥籽粒氨基酸的含量[6-7]。遺傳學研究發現，大麥籽粒氨基酸的含量受胚乳三倍體基因和母體植株二倍體基因的影響[8-9]。閆新甫等[10]進一步研究發現，二棱大麥籽粒中苯丙氨酸含量的遺傳存在直接加性效應和顯性效應，并存在明顯的直接顯性效應與環境互作。

通過構建作圖群體挖掘數量性狀位點是目前大麥QTL研究的主要方法。前人已經對大麥功能成分(γ-氨基丁酸[11]、蛋白質[11]、黃酮[12]等)以及農藝性狀(抗病性[13-14]、粒長[15]、粒重[16-17]、籽粒抽穗期[16-17]、穗高[18]、穗長[18]、葉面積[18]、葉寬[18]、株高[18]等)進行了QTL定位分析，但關于大麥氨基酸QTL定位研究鮮有報道。目前僅明確了控制大麥籽粒γ-氨基丁酸含量的QTL主要分布在3H、4H、5H和7H染色體上[11]，而關于大麥苯丙氨酸含量QTL的定位，目前還未見 報道。

本課題組在前期的研究中，發現一個籽粒苯丙氨酸含量比較高的品種(紫光芒裸二棱)，并利用該品種構建了重組自交系。本研究以該重組自交系為材料，測定群體及其親本籽粒的苯丙氨酸含量，并結合SSR標記和完備區間作圖法構建遺傳連鎖圖譜，挖掘大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL，以期為大麥籽粒高苯丙氨酸含量品種篩選以及大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL精細定位和克隆轉化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

重組自交系的構建與試驗材料種植參考楊曉夢等[11]的方法。親本及RIL群體193個株系種植于云南玉溪市，隨機區組排列，行長1 m，行距0.3 m，每行播種100粒種子，3次重復。復合肥(N∶P2O5∶K2O=13∶5∶7)為基肥，施肥量為純氮120 kg·hm-2，2012年11月6日出苗，2013年1月2日追肥純氮30 kg·hm-2，其他管理同當地常規高產麥田。待植株成熟后，親本及群體株系隨機選取3株，取平均值為最終測定值。將收獲的大麥籽粒編號分裝，曬干，去掉雜質后，用磨粉機磨細，收集粉末，低溫儲存，編號待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 苯丙氨酸含量的測定

采用日立-L8900全自動氨基酸自動分析儀測定群體及親本籽粒中苯丙氨酸的含量。

1.2.2 大麥總DNA的提取

參考孫正海等[19]的方法提取葉片基因組總DNA。以OD260/OD280比值在1.8～2.0為評價指標，使用紫外分光光度計(DU-7400)對DNA的純度進行檢測，同時用OD260值計算DNA濃度(DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數)。

1.2.3 SSR引物來源及篩選

本試驗所用500對SSR引物均勻覆蓋大麥基因組，引物序列來自網站(http://www.wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes)，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。合成的引物在兩個親本間進行多態性篩選，篩選出的多態性引物在群體內進行PCR擴增。PCR反應體系為10 μL，包括上下游引物各0.5 μL、DNA 2 μL、PCR Buffer 1.5 μL、dNTPs 0.4 μL、ddH2O 4.9 μL、Taq polymerase 0.2 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃最后延伸5 min，4 ℃保存。利用8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳進行擴增產物分離，銀染法顯色檢測。

1.2.4 SSR標記帶型記錄

將銀染顯色的凝膠于膠片觀察燈下讀帶，用QTL IciMapping V3.3軟件記錄：帶型和母本紫光芒裸二棱一致的記作“0”，和父本Schooner一致的記作“2”，雜合帶記作“1”，缺失記作“-1”。

1.2.5 QTL定位分析

利用已構建的大麥RILs群體的分子遺傳連鎖圖譜，用QTL IciMapping V3.3軟件中完備區間作圖法(ICIM)[20]對QTL進行定位，LOD值≥2.5作為QTL存在的閾值，確定苯丙氨酸含量QTL在染色體上的相對位置，估算其遺傳效應。QTL命名遵循Mccouch等[21]的原則。

2 結果與分析

2.1 RIL群體籽粒苯丙氨酸含量的表型變異

由圖1可知，RIL群體峰度值為0.77，偏度值為0.07，表明群體籽粒中苯丙氨酸含量分布為尖頂峰(右偏正態分布)，說明群體中苯丙氨酸含量較小的株系在群體中所占比重較大，且群體中苯丙氨酸中間含量株系相對較多。群體苯丙氨酸含量平均值介于兩親本之間，父本Schooner苯丙氨酸含量為0.60 mg·g-1，表現為低值親本；母本紫光芒苯丙氨酸含量為1.23 mg·g-1，為高值親本。群體籽粒苯丙氨酸含量在0.59～1.24 mg·g-1之間，變異系數為 2.04%。群體均值為 0.88 mg·g-1，低于親本均值(0.92 mg·g-1)，且出現了超親分離現象，具數量性狀特征，適合進行QTL定位分析。

2.2 RIL群體的遺傳連鎖圖譜

500對SSR引物中有180對可以獲得清晰且多態性好的條帶，上述標記在群體中的分離情況基本符合1∶1的孟德爾分離比例，為純合位點。利用180對親本間具有多態性好的引物進行群體擴增，構建7個連鎖群。結果(表1和圖2)表明，遺傳連鎖圖譜總長度為2 671.03 cM，平均遺傳距離為14.84 cM，其中，7H染色體覆蓋距離最長，為542.89 cM，且標記數量最多(39)，標記間平均遺傳距離為13.92 cM；6H染色體覆蓋距離最短，為233.72 cM，且標記數量最少(15)，標記間平均遺傳距離為15.59 cM。

表1 分子標記在大麥染色體上的分布Table 1 Distribution of markers on different chromosomes of barley

2.3 大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL定位結果

由表2可以看出，4個與大麥籽粒苯丙氨酸含量相關的QTL分別位于2H、4H、5H和7H染色體上，初步命名為qPHE-2H、qPHE-4H、qPHE-5H和qPHE-7H。4個QTL中，qPHE-2H和qPHE-7H為主效QTL，表型貢獻率均大于10%，其中，貢獻率最大的為qPHE-7H，位于大麥7H染色體 GMS056～GBM1297區間，表型貢獻率為15.45%；另一個主效QTL(qPHE-2H)位于2H染色體Scssr03381～scssr07759區間，表型貢獻率為12.32%。qPHE-4H、qPHE-5H為微效QTL，表型貢獻率為5.69%和6.96%。qPHE-2H、qPHE-5H和qPHE-7H的加性效應均為負值，表明其增效基因來自父本Schooner，而qPHE-4的加性效應為正值，表明增效基因來自母本紫光芒裸二棱。綜上可知，大麥籽粒苯丙氨酸含量是由主效和微效基因共同控制的數量 性狀。

表2 大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL的定位信息Table 2 Location information of QTL for phenylalanine content in barley grains

3 討 論

大麥營養價值豐富，由大麥制成的全麥食品被認為是“健康食品”[22]，對預防心血管疾病和癌癥等慢性病有極其重要的作用[23]。利用RIL群體構建遺傳連鎖圖譜，可分析QTL位點的加性效應，是植物QTL定位常用的作圖適宜群體。Teulat等[24]以大麥Tadmor×Er/Apm RIL群體為材料，檢測到12個控制有效分蘗、株高、穗粒數等7個農藝性狀的QTL。游 靜[25]利用栽培大麥和中東野生大麥構建的RIL群體為材料，檢測到14個控制粒長、穗粒數、株高等農藝性狀的QTL。楊 濤等[26]以云啤2號與大粒麥構建的RIL群體為材料，在兩年間發現了2個與抗性淀粉含量相關的QTL。Tamang等[27]利用Tradition×Pinnacle構建的RIL群體為材料，在2H、3H、4H、6H和7H染色體上檢測到12個控制大麥點狀網斑病的QTL。

目前關于大麥籽粒蛋白質含量QTL[28-31]和γ-氨基丁酸含量QTL的相關報道[11,32-33]較多，而關于大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL則未見報道，因此，本研究發現的4個苯丙氨酸含量QTL均為新位點，分別為qPHE-2H、qPHE-4H、qPHE-5H和qPHE-7H。通過與大麥參考基因組比對，發現2個主效 QTL(qPHE-2H和qPHE-7H)區間與其對應的物理位置有較好的一致性。進一步對苯丙氨酸含量QTL定位區間分析發現，本研究在2H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(Scssr03381～scssr07759)，與郭蕾蕾[34]在2H染色體上發現的控制大麥抽穗期QTL(Scssr03381～MzE8b)和成熟期QTL(M3E7C～scssr07759)以及楊曉夢等[35]在2H染色體上發現的控制大麥籽粒千粒重QTL(Scssr03381～scssr07759)存在相同的標記；本研究在4H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(HVBAMMGB84～BMAG0808)與楊曉夢等[11]在4H染色體上發現的控制大麥籽粒蛋白質含量QTL(BMAG0740～BMAG0808)存在相同的標記；本研究在5H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(Scssr03907～GBMS0032)與余春磊[36]在5H染色體上發現的控制大麥籽粒楊梅素含量QTL(MS002～Scssr03907)以及楊 濤[26]在5H染色體上發現的控制大麥籽粒抗性淀粉QTL(Scssr03907～Gm2)存在相同的標記；本研究在7H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(GMS056～GBM1297)與楊曉夢等[35]在7H染色體上發現的控制大麥籽粒千粒重QTL(GBM1297～GMS056)存在相同的標記。推測這些性狀可能與大麥籽粒苯丙氨酸含量之間存在關聯或存在“一因多效”現象。控制大麥籽粒苯丙氨酸含量的QTL除受基因型影響之外，還受環境影響[5]。本研究僅進行了單年單點試驗，下一步將進行多年多點試驗，以期獲得更準確的與苯丙氨酸含量相關的QTL。