QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測牛奶中11種激素類藥物殘留

陳 娟,李永琴,卜寧霞,馬 巖,楊 奇

(寧夏獸藥飼料監察所,寧夏銀川，750011)

激素類藥物對動物生理過程起著重要調節作用，可用于治療動物疾病，促進動物生長發育、提高產量、增加蛋白沉積等[1]。奶牛在哺乳期會分泌一定量的激素，但養殖者為了加速奶牛發育和延長哺乳期會人為加入外源激素，并通過血液循環在牛乳中積累[2]，牛乳中蓄積的激素藥物會對人體健康造成較大危害，如增加生殖系統癌癥風險[3-4]、誘發免疫性疾病[5]和影響兒童生長發育等[6]，因此歐盟禁止在動物生產中使用激素藥物[7]，我國也在《食品安全國家標準動物性食品中獸藥最高殘留限量》(GB 31650-2019)和農業農村部第250號公告中分別對限用和禁用的激素類藥物做出了相應規定[8-9]。

目前，國內外激素類藥物的檢測方法主要有高效液相色譜法[10]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[11-12]、液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)[13-15]等，HPLC-MS具有樣品前處理簡單、靈敏度高、特異性強等優勢，已經廣泛應用于激素類痕量藥物殘留測定。但針對牛奶中激素檢測方法的相關研究較少，且檢測藥物種類少、覆蓋面窄，Liu Kun[10]等建立了牛奶中5種激素的自動在線固相萃取-高效液相色譜聯用的檢測方法，尤亮亮[13]等利用固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法測定了牛奶中9種性激素殘留。同時《食品安全國家標準 動物源食品中激素多殘留檢測方法液相色譜-質譜法》(GB/T 21981-2008)中對激素殘留測定的前處理方法繁瑣、費時、成本高[16]，不能夠滿足快節奏、大批量的檢測需求。

QuEChERS法是一種快速、簡易、廉價、有效、穩定、安全的前處理方法，現已廣泛應用于獸藥殘留檢測領域[17]。本研究利用QuEChERS法，通過優化前處理方法，結合超高效液相色譜-串聯質譜技術，實現對群勃龍、諾龍、甲基睪酮、睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、勃地龍、司坦唑醇、美雄酮、丙酸睪酮共11種藥物快速、高效的定性定量測定，可為牛奶中激素類藥物監控提供技術支撐，保障牛奶質量安全。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC-Xevo TQ-s micro超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(美國Waters公司)；AE-205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；CT15RT高速冷凍離心機(日本HITACHI公司)；氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；Milli-Q integra 5超純水儀(美國Millipore公司)；多管渦旋振蕩器(安簡(北京)科技有限公司)。

1.2 試劑與材料

1.2.1 標準品 群勃龍、諾龍、甲基睪酮、睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、勃地龍、司坦唑醇、美雄酮、丙酸睪酮藥物標照品(純度≥95 %，除苯丙酸諾龍來源于中國食品藥品檢定研究院、美雄酮來源于上海安譜公司外，其他標準品均來源于德國Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2.2 材料 Cleaner MAS-Q 凈化管(天津博納艾杰爾有限公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；乙酸乙酯(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司)；甲酸(質譜純，美國Fisher公司)；所用水為超純水。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱為美國 Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A相為乙腈，B相為0.1 %甲酸水溶液；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。流動相梯度見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.3.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；毛細管電壓：1.0 kV；源溫：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；霧化氣流速：1000 L/h；錐孔氣流速：50 L/h。11種激素類藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 11種待測藥物質譜條件

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品提取 準確稱取混勻后的牛奶樣品(2±0.05) g，置于50 mL塑料離心管內，加入乙酸乙酯10 mL，旋渦提取5 min，10000 r/min離心5 min，取上清液于15 mL具塞玻璃試管中，45 ℃氮氣吹至近干。殘留物用2 mL0.1 %甲酸乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1)溶解。

1.4.2 樣品凈化 取上清液1.5 mL至Cleanert MAS-Q凈化管中，渦旋振蕩1 min，10000 r/ min離心5 min，取上清液過微孔濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4.3 標準溶液的配制 標準儲備液配制：分別精密稱取11種激素類藥物對照品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配置成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃可保存6個月。標準工作液：分別準確吸取標準儲備液適量，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成適宜濃度的混合標準工作液。

1.4.4 標準曲線繪制 準確吸取混合標準工作液適量，用空白樣品提取液配成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10、50、100 ng/mL的基質匹配混合標準工作溶液，從低濃度到高濃度測定，每一濃度進樣3針，以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 線性關系 精密量取標準工作液適量，用空白基質稀釋成含各藥物濃度分別為0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL的系列混合標準工作液，充分混勻，過微孔濾膜，作為基質匹配標準溶液上機測定。以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標(y)，基質匹配標準溶液濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，擬合回歸方程。圖1為0.5～100 ng/mL基質匹配標準溶液標準曲線圖，11種激素類藥物的回歸方程及相關系數r見表3，由表3可以看出，11種藥物在0.5～100 ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性關系，r均大于0.998。

圖1 基質匹配標準溶液標準曲線圖(0.5～100 ng/mL)

表3 11種激素類藥物線性回歸方程及相關系數

2.2 定量限 添加適量100 ng/mL混合標準溶液于2 g空白牛奶中，前處理后測定，依據各工作溶液對應峰的信噪比S/N>10(按PtP算)，確定出激素類藥物的定量限為1 μg/kg。

2.3 方法精密度與準確度 在空白牛奶中分別添加適量標準溶液，制成1、2、10 μg/kg三個不同濃度的空白添加試樣，每批次同一濃度做5次平行試驗，重復3次，進行回收率試驗。試驗結果見表4，由表4可以看出，空白牛奶中添加11種激素類藥物添加回收率均在60.3 %～119.6 %；批內相對標準偏差在1.7 %～10.9 %；批間相對標準偏差在0.2 %～12.1 %，完全符合我國關于獸藥殘留檢測試驗技術規范的要求[23]。1 ng/mL空白牛奶基質匹配標準溶液中11種激素類藥物特征離子質量色譜圖見圖2。

表4 11種激素類藥物的加標回收率和精密度(n=5)

圖2 11種激素類藥物特征離子質量色譜圖(1.0 ng/mL)

3 討論與結論

3.1 質譜條件的優化 實驗采用各藥物0.2 μg/mL的標準溶液分別在電噴霧離子源正、負離子模式下，采用流動泵連續進樣方式進行全掃描，在多反應監測模式下對質譜條件進行優化。結果發現：這11種激素類藥物均在正離子模式下響應強度大，在此基礎上選擇豐度較強、干擾最少的兩個子離子作為定性離子，其中豐度最強的子離子作為定量離子，同時確定出最佳碰撞能量和錐孔電壓，具體質譜采集參數見表2。

3.2 提取溶劑的確定 目前，國內外激素類藥物殘留檢測常用的提取溶劑主要為乙腈[10、18]、叔丁基甲醚[19]、乙酸乙酯[20]等。因此，實驗采用空白添加法，分別考察了乙酸乙酯、乙腈、1 %甲酸乙腈溶液和叔丁基甲醚作為提取溶劑的提取效率。結果表明：叔丁基甲醚提取效率較低，乙酸乙酯和乙腈提取效率較高，但乙腈易使牛奶中的蛋白質變性、乳化，影響提取效果[21]，且作為提取劑也會將牛奶中的水分也提出，降低氮吹濃縮速度，因此選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

3.3 凈化方法的確定 QuEChERS凈化方式所使用的吸附劑可將樣品中的雜質、有機成分通過吸附、凈化作用除去，減小樣品基質對提取液中目標化合物的干擾，尤其是高蛋白、高脂肪的牛奶樣品。實驗采用HLB柱(500 mg/6 mL)、HLB柱(60 mg/3 mL)和Cleaner MAS-Q凈化管分別對樣品進行凈化處理，考察樣品凈化效果和目標藥物回收率。結果發現，三種方法均能起到較好的凈化效果，但采用兩種HLB柱凈化后，丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍和司坦唑醇4種藥物回收率較低(僅為20 %～50 %)，而采用Cleaner MAS-Q凈化管凈化后，11種藥物回收率在60 %～120 %，這可能是因為Cleaner MAS-Q凈化管中的吸附劑填料較為豐富，主要有PSA、PC、C18和MgSO4，其中PSA對脂類和糖類的去除效果較好，C18可去除脂類等物質[22]，因此，為保證凈化效果和回收率，實驗選擇Cleaner MAS-Q凈化管凈化樣品，同時此方法還可在凈化后直接收集上清液，過濾膜后上機檢測，節省傳統方法中的固相萃取和濃縮步驟，具有快速、節約、簡單的優勢。

研究建立了QuEChERS前處理方法結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中11種激素類藥物殘留的檢測方法。樣品用乙酸乙酯提取，離心后氮吹濃縮，經0.1 %甲酸50 %乙腈水溶液復溶后用Cleanert MAS-Q凈化管凈化，過微孔濾膜后供UPLC- MS/MS測定。該方法在優化前處理方式后具有快速、節約、簡單的優勢，并在0.5～100 ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性關系，r均大于0.998。在1～10 μg/kg添加水平下，藥物添加回收率均在60.3 %-119.6 %，批內相對標準偏差在1.7%～10.9 %，批間相對標準偏差在0.2 %～12.1 %，定量限為1 μg/kg。該方法簡捷、準確、靈敏度高，可滿足對牛奶中多種激素藥物殘留監測的需要。