青藏高原鉆葉龍膽的遺傳分化與種群動態歷史研究

付鵬程，劉玉玉，史明艷

(洛陽師范學院 生命科學學院，河南洛陽 471934)

青藏高原地區是全球生物多樣性熱點地區之一[1]，孕育了大量特有物種，是研究植物遺傳分化與適應性進化的熱點地區[2-4]。大量生物地理學研究[5-7]和譜系地理學研究[4, 8]均表明，青藏高原地區植物遺傳分化受到了造山運動和冰川運動及其引發的環境與氣候變化的深刻影響[4, 8-10]。然而，不同物種對環境與氣候變化的響應模式存在較大的差異。例如，不同植物具有不同類型的冰期避難所與擴張模式[10]，高山植物對全球氣候變化的響應有別于低海拔植物[11]。因此，探討青藏高原地區植物尤其是特有物種的遺傳分化及其對過去環境與氣候變化的響應模式，可以為深入理解全球氣候變化背景下的植物進化與多樣性形成提供參考。

龍膽屬植物是典型的高山植物，以青藏高原及其周邊地區為分布中心和分化中心，不僅是中國植物多樣性的重要組成部分，還具有很高的藥用和觀賞價值[12]。龍膽屬共分為14個組，其中小龍膽組(sectionChondrophyllaes.l.)是龍膽屬中最大的類群，大多數為一年生草本，共有168種，占龍膽屬物種總數的46.41%[12-14]。已有的進化研究表明，小龍膽組是一個快速分化類群[15-16]，起源于青藏高原地區，隨后擴散到東亞、歐洲和美洲等地[17]。目前已對少量龍膽屬物種開展了遺傳分化和譜系地理學研究[18-22]，對龍膽屬的物種形成及其對氣候變化的響應模式等科學問題有了初步認識，但無一涉及小龍膽組這一龐大的類群，對小龍膽組在青藏高原的遺傳分化及其對氣候變化的響應缺乏了解。

鉆葉龍膽(GentianahaynaldiiKanitz)是小龍膽組中的常見物種之一，一年生草本，二倍體(2n = 18、20)[23-25]，是青藏高原特有植物。鉆葉龍膽曾隸屬于柱果組(sectionDolichocarpa)[12]，但由于柱果組在分子系統發育樹中不是一個單系群[13,17,26]，在最新的龍膽屬分類系統中，柱果組已合并到小龍膽組中[14]。葉綠體基因組的比較研究表明，鉆葉龍膽的葉綠體基因組發生了大量基因缺失和序列缺失，變異模式與小龍膽組其他物種類似，可能與適應青藏高原的氣候變化有關[17]。

本研究以青藏高原地區的鉆葉龍膽種群為研究對象，結合母系遺傳和雙親遺傳的分子標記探討鉆葉龍膽的種群遺傳分化和種群動態歷史，以期為龍膽以及高山植物的進化研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在青藏高原地區采集鉆葉龍膽11個種群共135個個體，基本覆蓋該物種的地理分布范圍，種群內每個個體間距至少10 m。由于鉆葉龍膽植株矮小，選取整株用干燥硅膠快速干燥，密封保存于-20 ℃中。憑證標本存于洛陽師范學院標本館。詳細的采樣信息見表1。

1.2 方 法

1.2.1 分子數據獲取用CTAB法[25]提取總DNA，用1%瓊脂糖檢測。選用通用的ITS1a-ITS4引物[27]和葉綠體trnS-trnG引物[28]進行PCR擴增，擴增體系和擴增反應參見文獻[21]。將PCR產物純化后用ABI3730xl(Applied Biosystems, USA)進行測序。

1.2.2 遺傳分化與種群動態分析使用軟件GENEIOUS PRO 3.5.6[29]查看測序結果，并進行序列比對。在軟件DnaSP 5.1[30]中統計單倍型個數，對于有雜合位點的ITS序列，用PHASE[31]按默認參數進行基因分型。在ARLEQUIN 3.5[32]中計算基因多態性(h)與核苷酸多態性(π)，并通過分子變異分析(AMOVA)[33]檢測遺傳變異在居群內和居群間的分布情況。用PERMUT[34]計算居群遺傳分化系數GST和NST，并對算得的GST和NST做1 000次重復的置換檢驗，以檢測單倍型的分布是否具有顯著的地理結構。在ARLEQUIN 3.5[32]進行歧點分布(mismatch distribution)分析和中性檢測分析，計算Fu’sFs[35]和Tajima’sD值[36]。

采用最大似然法，在IQ-TREE[37]中基于單倍型構建系統發育樹，核苷酸替換模型由IQ-TREE自動計算，設置Bootstrap為1 000。用最大簡約法在軟件NETWORK 4.6[38]中構建單倍型的中央網絡連接圖。

用軟件BEAST 1.7.5[39]，基于貝葉斯馬爾科夫鏈-蒙特卡洛鏈方法(Bayesian MCMC)估算鉆葉龍膽各支系的分化時間。選用Yule process、嚴格分子鐘模型進行計算。由于龍膽屬已發現的化石非常少，加之本研究中未包含龍膽屬全部主要類群，因此采用兩種方法對分化時間估算進行校正。首先，選用龍膽屬僅有的秦艽化石來標定外類群的共同祖先時間[17]；其次，依據Favre等[17]的結果，約束龍膽屬冠群時間的中位數為29.76個百萬年(Ma)。分析時做3次獨立運算，每次運算10 000 000代，每隔1 000代取一棵樹，去掉前20%的預熱樹(burn-in)。用Tracer 1.5(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/)查看有效采樣規模(effective sample size, ESS),保證所有指標均大于200。采用TreeAnnotator 1.7.5[40]基于有效樹產生一棵分支分化時間樹。

1.2.3 物種分布模型從GBIF(Global Biodiversity Information Facility)中下載鉆葉龍膽的分布記錄，結合本研究記錄的物種分布記錄，在ArcGIS 10.2中移除間距小于10 km的分布點。從WorldClim下載目前、中全新世(mid-Holocene，～6 kya)、末次盛冰期(LGM，～22 kya)和末次間冰期(LIG，～120-140 kya)的19個生物氣候因子。為了避免多重共線性的影響，在SPSS 2.0中計算生物氣候因子間的皮爾森相關系數，去掉皮爾森相關系數顯著大于0.9的生物氣候因子。用軟件MaxEnt 3.4.1[41]預測鉆葉龍膽在不同時期的物種分布范圍。將75%的分布數據用作訓練集，剩下的25%用作測試集，用AUC值對模型進行評估。

2 結果與分析

2.1 遺傳分化與遺傳結構

葉綠體分子標記在鉆葉龍膽中共有4處堿基替換和一處缺失/插入，共鑒定7個單倍型(cH1—cH7；GenBank登錄號MT492502—MT492508)。香格里拉(XGLL)和玉樹(YS2)種群包含的單倍型較多，分別是4個和3個，而有4個種群僅包含1種單倍型(表1，圖1)。核分子標記在鉆葉龍膽中共有30處堿基替換，共鑒定78個基因型(H1—H78；GenBank登錄號MT483797—MT483859)，其中大部分基因型為單個種群所獨有(表1，圖1)。葉綠體數據和核基因數據均表明，香格里拉(XGLL)、道孚(DF)和甘孜(GZ)種群的遺傳多樣性最高。基于葉綠體數據計算得到的遺傳分化系數GST和NST分別是0.178和0.574(P<0.05)，基于核基因數據算得的遺傳分化系數GST和NST分別是0.511和0.630(P<0.01)，均表明鉆葉龍膽具有顯著的譜系地理結構。分子變異分析的結果表明，鉆葉龍膽中發生在種群間的遺傳變異略高于發生在種群內的變異；其中種群間的遺傳變異在葉綠體數據中占比53.14%，在ITS數據中占比51.12%(表2)。遺傳分化系數FST在葉綠體數據和ITS數據中分別為0.531和0.511。

表1 本研究中鉆葉龍膽的樣品信息與遺傳多樣性指數

鉆葉龍膽葉綠體單倍型間沒有清晰的系統發育關系，分化時間分析表明鉆葉龍膽葉綠體單倍型的分化發生在1.6 Ma(95%置信區間: 0.66-2.65 Ma)(圖2，A)，在地質時間上處于第四紀更新世。中央網絡連接圖表明單倍型cH2位于網絡中央，表明鉆葉龍膽種群大小在近期發生過擴張(圖2，B)。

表2 鉆葉龍膽種群分子變異分析

A.枝上數值表示貝葉斯后驗概率，主要節點的分化時間用箭頭表示，灰條表示95%的置信區間；B. 圖中圓圈大小表示單倍型數量圖2 基于葉綠體數據的鉆葉龍膽單倍型(cH1-cH7)分化時間(A)與中央網絡連接圖(B)A. Numbers on the branches indicate Bayesian posterior probabilities; node age estimates are marked with black arrows; grey bars represent 95% highest posterior densities； B. Pie charts display number of each haplotypeFig.2 Results of divergence time and median-joining network among chloroplast haplotypes (cH1-cH7) in Gentiana haynaldii

2.2 種群動態歷史與物種歷史分布范圍

基于葉綠體和ITS數據的分析結果表明，鉆葉龍膽的歧點分布圖均為多峰曲線(圖3)，說明在較長時間段內種群大小相對穩定。基于葉綠體數據的中性檢驗結果顯示，Fu’sFs為-2.247(P=0.154)，Tajima’sD為-0.533(P=0.389)；ITS數據顯示Fu’sFs為-24.532(P=0)，Tajima’sD為1.229(P=0.909)。

A. 葉綠體數據；B. nrITS數據圖3 鉆葉龍膽歧點分布分析曲線圖A. Plastid data; B. nrITS dataFig.3 Result of mismatch distribution analysis of Gentiana haynaldii

通過泊松相關性分析，保留了9個生物氣候因子(bio1-bio4，bio7，bio12-bio15)用于鉆葉龍膽的歷史分布區重建。結果表明，鉆葉龍膽從末次間冰期到現在的歷史分布范圍比較穩定，僅在全新世中期有小幅度的收縮，隨后向北小幅擴張到現今的分布范圍(圖4)。

A.現在; B. 中全新世(～6 kya); C. 末次盛冰期(～22 kya); D. 末次間冰期(～120-140 kya)圖4 基于物種分布模型模擬鉆葉龍膽的潛在適宜分布區A. Current; B. Mid Holocene (～6 kya); C. Last Glacial Maximum (～22 kya); D. Last Interglacial (～120-140 kya); The value of predicted habitat suitability is indicated by the bars in each panelFig.4 Estimated climatic niches for distribution of Gentiana haynaldii

3 討 論

本研究表明，小龍膽組鉆葉龍膽經歷了近期的種內遺傳分化，遺傳多樣性較高。鉆葉龍膽的遺傳分化系數FST在葉綠體數據和ITS數據中分別為0.532和0.511，高于龍膽屬其他多年生物種，如阿墩子龍膽(G.atuntsiensisW.W. Smith，FST= 0.232，AFLP數據)[42]、多花龍膽(G.striolataT.N. Ho，FST= 0.226，AFLP數據)[42]、何氏秦艽(G.hoaeP.C. Fu & S.L. Chen,FST= 0.185，葉綠體數據；FST= 0.423，ITS數據)[21]、線葉龍膽[G.lawrenceivar.farreri(Balf. f.) T. N. Ho,FST= 0.488，葉綠體數據；FST= 0.175，SSR數據][19]。雖然目前已對青藏高原地區植物開展了大量遺傳分化與進化研究，但絕大多數以多年生植物為研究對象，以一年生植物為對象的進化研究較少，僅見于一年生植物星葉草(CircaeasteragrestisMaxim，FST= 0.128-0.891，基因組數據)[43]和二年生植物羽葉點地梅(PomatosacefiliculaMaxim.，FST= 0.560，葉綠體數據)[44]等，二者種內遺傳分化程度均很高，與鉆葉龍膽相似。雖然不同研究所用分子標記的遺傳方式和分辨率有所不同，遺傳分化系數FST絕對值不能簡單進行直接比較，但這些結果也足以表明鉆葉龍膽種內遺傳分化程度高，且普遍高于多年生龍膽屬植物。

鉆葉龍膽的高遺傳分化程度可能有四方面的原因。第一，鉆葉龍膽是一年生草本植物，由于世代周期短，進化速率快[15-16]，加速了遺傳變異的積累。第二，自花授粉植物由于基因流減弱，利于遺傳分化的發生。雖然目前缺乏詳細的鉆葉龍膽傳粉生態學資料，但由于小龍膽組植物多為自花授粉，鉆葉龍膽也具備自花授粉的形態特征[12]，因此，其傳粉生態學特征也是鉆葉龍膽遺傳分化程度高的成因之一。第三，鉆葉龍膽分布地區多為山脈峽谷地貌，易于形成片段化生境，起到了降低居群間基因流的作用，從而促進了種內的遺傳分化。第四，過去環境與氣候變化對種群動態的影響。基于分子鐘模型的估算表明鉆葉龍膽的種內分化發生在第四紀冰期以來。該時間段的青藏高原地區無劇烈的造山運動，以反復的冰川運動為主[3, 5]，因此，第四紀冰期以來的環境與氣候變化是鉆葉龍膽遺傳分化的主要外部誘因。由于鉆葉龍膽是典型的高山植物，分布海拔范圍為2 100～4 200 m[12]，因此在氣候變冷時其分布范圍在青藏高原地區傾向于增大，而在氣候變暖時其分布范圍縮小，這與本研究的物種分布模型結果以及其他高山植物相一致[11]。在應對環境與氣候變化過程中的生境片段化和天空島效應(sky island)[45-46]可能是鉆葉龍膽遺傳分化的主要機制。

葉綠體數據顯示鉆葉龍膽種群的遺傳多樣性水平在云南與四川西部較高。雖然該地區是眾多高山植物的冰期避難所[8-10, 47]，由于鉆葉龍膽分化時間較短，本研究中單倍型間的系統發育關系不夠明確，無法確定種內單倍型的進化歷程，因而基于現有數據尚無法鑒定出一個明顯的冰期避難所。此外，核基因數據顯示鉆葉龍膽沒有明顯的遺傳多樣性中心與分化中心，大部分單倍型為種群所獨有。這種分布式樣與一些高山植物和冰緣植物類似[10, 48]。

種群進化歷史分析結果中，中性檢驗和中央網絡圖表明鉆葉龍膽發生整體擴張，但歧點分布分析結果表明其近期種群大小穩定。不同種群進化歷史分析方法的結果不一致在基于DNA片段數據分析時比較多見，如青藏高原一些冰緣植物[48]等。這種不一致可能有多種原因，包括復雜遺傳結構和有限的變異位點均可能對歧點分布分析產生影響。因此，鉆葉龍膽的種群進化歷史還有待進一步研究。