外源褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗抗氧化能力以及光合作用效率的影響

趙麗娟，麻冬梅，王文靜，馬巧利，李嘉文，蘇立娜

(寧夏大學(xué) 西北土地退化與生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 銀川 750021)

非生物脅迫，特別是鹽、堿、重金屬、干旱和極端溫度正成為植物充分發(fā)揮遺傳潛力的阻礙，限制了世界范圍內(nèi)的作物產(chǎn)量[1-2]。其中，鹽分是作物生產(chǎn)力最嚴(yán)重的障礙之一，植物中過量的鹽分表現(xiàn)為滲透脅迫和離子毒性的結(jié)合，造成活性氧的積累而導(dǎo)致氧化脅迫[3]。植物有各種各樣的策略來應(yīng)對這些脅迫，包括通過根系吸收和運(yùn)輸?shù)饺~片來調(diào)節(jié)離子平衡，積累相容的溶質(zhì)，如碳水化合物和脯氨酸，以及通過增加抗氧化物酶活性來清除活性氧，主要包括過氧化物酶、超氧化物歧化酶等[4]。中國鹽堿地的面積總量達(dá)9913萬 hm2，主要分布在東北、華北、西北，鹽堿地的開發(fā)利用具有重大價值[5]，因此，通過培育耐鹽堿品種來對土壤進(jìn)行改良是當(dāng)前研究者密切關(guān)注的問題之一。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種優(yōu)良的多年生豆科牧草，在中國種植廣泛，是最重要的飼用作物之一。因其蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)價值豐富、生物產(chǎn)量高，被譽(yù)為“牧草之王”，對畜牧業(yè)發(fā)展有著十分重要的作用[6，1]。紫花苜蓿對所處生長環(huán)境的土壤質(zhì)量要求不高，可以在輕度鹽堿地生長，是中等耐鹽植物，為改良鹽堿地做出了很大貢獻(xiàn)。但是高濃度鹽脅迫對苜蓿生長、根瘤形成和共生固氮能力產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重限制了高鹽環(huán)境下苜蓿的生物量[7]。目前，中國苜蓿種植區(qū)土壤鹽堿化問題嚴(yán)重，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降嚴(yán)重，提高苜蓿品種的耐鹽性是提高苜蓿產(chǎn)量的重要方法[8]。

褪黑素(Melatonin，MT)是一種生物刺激因子，屬于吲哚雜環(huán)類化合物，最初在維管植物中發(fā)現(xiàn)，其主要作用是作為一種抗氧化分子，通過降低活性氧(ROS)、活性氮 (RNS)和調(diào)節(jié)相關(guān)基因來應(yīng)對氧化脅迫，增強(qiáng)植物抗逆性[8-9]。迄今，已有許多文獻(xiàn)報道，褪黑素浸種能有效提高植物的抗逆性，引發(fā)改善植物水分狀況，提高玉米幼苗抗旱性[10]，并顯著緩解高鹽脅迫下紫花苜蓿種子發(fā)芽率的下降[8]以及鈉鉀離子失衡造成的損傷[11]。而在農(nóng)業(yè)耕作中，種子適宜干播的作物只能采用葉面噴施和根灌的方法進(jìn)行相關(guān)處理，其中根灌法對植物來說是最有效的、最易獲取營養(yǎng)的方法。采用根灌法研究褪黑素對植物在逆境環(huán)境下的影響甚少，為了研究不同濃度褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長和生理指標(biāo)的影響，本試驗(yàn)以紫花苜蓿品種‘中苜1號’為材料，采用水培根灌褪黑素的方法來考察褪黑素對鹽脅迫的緩解作用，為利用褪黑素提高紫花苜蓿耐鹽性和鹽堿地的改良提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

參試紫花苜蓿(MedicagosativaL.)品種為 ‘中苜1號’，種子由曹致中老師饋贈。選取飽滿種子適量，用2%的次氯酸鈉溶液消毒7 min，期間不斷搖晃，無菌水沖洗4-5次后，備用。

1.2 鹽和褪黑素濃度篩選

首先，選取40粒種子放置于有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用不同濃度的氯化鈉(100、125、150、200、250 mmol/L)和褪黑素(5、30、50、80、100、200 μmol/L)分別浸濕，并以去離子水作為對照，共12個處理，每個處理3次重復(fù)。種子先在25 ℃暗培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)至23 ℃/25 ℃、光周期為16 h/8 h條件下進(jìn)行光培養(yǎng)，5 d后，測量根長，計算萌發(fā)率。

其次，選取40粒種子置于有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用不同濃度(0、5、30、50、80、100、200 μmol/L)的褪黑素和150 mmol/L NaCl共同(v/v=1∶1)浸濕復(fù)合處理，共7個處理，各處理3次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上，5 d后測量根長，計算萌發(fā)率。

1.3 鹽和褪黑素復(fù)合處理

試驗(yàn)設(shè)置8個處理：CK(對照，去離子水)、NaCl(150 mmol/L氯化鈉)、MT1(30 μmol/L褪黑素)、MT2(50 μmol/L褪黑素)、 MT3(80 μmol/L褪黑素)、NaCl+MT1(150 mmol/L 氯化鈉+30 μmol/L褪黑素)、NaCl+ MT2(150 mmol/L 氯化鈉+50 μmol/L褪黑素)、NaCl+MT3(150 mmol/L 氯化鈉+80 μmol/L褪黑素)，選取40粒種子置于3層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用相應(yīng)褪黑素濃度和鹽濃度配比(v∶v=1∶1)處理液浸濕，培養(yǎng)條件同上，每個處理3次重復(fù)，將萌發(fā)5 d后的幼苗移至水培盒(127 mm×87 mm×114 mm)進(jìn)行培養(yǎng)，水培液為相應(yīng)褪黑素濃度和鹽濃度配比(v∶v=1∶1)處理液，以去離子水作對照(CK)，每3 d更換1次水培液，取水培培養(yǎng)7 d的紫花苜蓿幼苗測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長指標(biāo)取水培盒中生長7 d后的紫花苜蓿幼苗，首先用卷尺測量幼苗根長和株高，分離根的樣本，先測定鮮重，再放入105 ℃烘箱烘干至恒重，稱取干重。分離葉片，采用剪紙稱重法測定葉面積[12]，葉面積=100×待測葉葉形紙重量/100 cm2紙重，每個處理3次重復(fù)。

1.4.2 丙二醛和相對電導(dǎo)率葉片丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定[13]，測定532、600、450 nm波長下的吸光度值OD532、OD600和OD450，依據(jù)公式計算丙二醛含量[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450×提取液體積/植物組織鮮重(g)，μmol/g]，每個處理3次重復(fù)。另外，稱取100 mg葉片浸入去離子水中，并在37 ℃下培養(yǎng)2 h，然后使用電導(dǎo)率儀(STARTER 3100C)測量溶液的電導(dǎo)率(E1)；將樣品抽真空15 min，冷卻至室溫后測量總電導(dǎo)率(E2)；使用公式計算相對電導(dǎo)率(E1/E2×100)[14]，每個處理測量3次重復(fù)。

1.4.3 相對含水量葉片稱鮮重，然后將葉片浸入蒸餾水中24 h，隨后吸干表面水分，并記錄飽和重。在60 ℃的烘箱中干燥樣品，記錄干重。使用公式估算相對含水量(RWC)，每個處理測量3次重復(fù)。

RWC(%)=[(鮮重-干重)/(飽和重-干重)]×100%

1.4.4 脯氨酸含量和抗氧化酶活性葉片脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸提取，茚三酮比色法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定，均采用陳建勛所描述的方法[15]，每個處理測量3次重復(fù)。

1.4.5 光合指標(biāo)在天氣晴朗的中午9:00～11:00采用便攜式光合作用儀 (Li-6400XT, 美國) 測定紫花苜蓿幼苗頂部完全張開的葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，每個處理測量3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計分析用SPSS 22.0，用GraphPad繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鹽和褪黑素處理下紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長情況比較

褪黑素有益于植物的生長發(fā)育并且具有緩解各種非生物脅迫危害的功能，在進(jìn)行褪黑素緩解鹽脅迫實(shí)驗(yàn)前，需要先篩選出合適的鹽和褪黑素濃度。與對照相比，各濃度鹽處理紫花苜蓿幼苗根長均大幅下降，植株明顯矮小，根長在100和200 mmol/L鹽處理下分別顯著降了75.15%和93.93%(圖1，A、B)；同時，就種子萌發(fā)率來看，紫花苜蓿種子在250 mmol/L鹽處理下沒有萌發(fā)(圖中未顯示)，在100 mmol/L鹽處理下萌發(fā)率無顯著變化，在125、150、200 mmol/L鹽處理下萌發(fā)率顯著降低，分別達(dá)到85.5%、38.3% 和6.7%(圖1，C)。由于200 mmol/L鹽脅迫后紫花苜蓿幼苗趨近死亡狀態(tài)，最終以150 mmol/L NaCl作為本試驗(yàn)鹽脅迫的最佳濃度。

同時，為評價褪黑素對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，進(jìn)一步對褪黑素處理濃度進(jìn)行篩選。首先，在無鹽脅迫條件下，紫花苜蓿種子經(jīng)不同濃度的褪黑素(0、5、30、50、80、100、200 μmol/L)處理后，其根系較不處理時短粗(圖1，D)，種子萌發(fā)率無明顯變化(圖1，E)。其次，經(jīng)150 mmol/L NaCl與不同濃度褪黑素(v∶v=1∶1)共同施加篩選出褪黑素對鹽脅迫緩解的最佳濃度。其中，各濃度褪黑素處理紫花苜蓿幼苗生長情況均比單獨(dú)鹽脅迫處理明顯好轉(zhuǎn)，且30、50、80 μmol/L的褪黑素濃度處理的紫花苜蓿幼苗生長狀況較好(圖1，F(xiàn))；種子萌發(fā)率均比單獨(dú)鹽脅迫處理顯著提高，但各濃度褪黑素處理間無顯著差異(圖1，G)；幼苗根長隨著褪黑素濃度的增加先升高后降低，但各濃度褪黑素處理均比單獨(dú)鹽脅迫處理不同程度提高，并以30、50、80 μmol/L褪黑素處理顯著高于其余處理(圖1，H、I)。因此，適宜濃度褪黑素處理能顯著緩解鹽脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)、幼苗生長造成的傷害，并以30、50、80 μmol/L褪黑素的效果最好，最終選擇這些濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A-C.NaCl處理：A.根系形態(tài)；B.根長；C.萌發(fā)率；D-E.褪黑素處理：D.根系形態(tài); E.萌發(fā)率; F-I. 鹽(150 mmol/L的NaCl)和不同濃度褪黑素復(fù)合處理：F.生長狀況；G.萌發(fā)率；H.根系形態(tài)；I.根長；不同的小寫字母表示在處理之間在0.05水平存在顯著性差異，下同圖1 苜蓿種子在不同濃度NaCl、褪黑素及鹽與褪黑素復(fù)合處理5 d 后的萌發(fā)狀態(tài)A-C. NaCl treatment: A. root morphology; B. Root length; C. Germination rate; D-E. Melatonin treatment: D. Root morphology; E. Germination rate; F-I. Salt and melatonin combined treatment: F. Growth status; G. Germination rate; H. Root morphology; 1. Root length; Different normal letters showed significant differences at the level of 0.05; the same as belowFig.1 Germination state of alfalfa seeds under different concentrations of NaCl, melatonin and salt stress combined with melatonin for 5 days

2.2 褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長的影響

表1顯示，紫花苜蓿幼苗所有生長指標(biāo)(根長、株高、葉面積、根鮮重和根干重)在單獨(dú)鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)下分別比對照(CK)顯著下降了42.15%、12.4%、38.68%、45.45%和44.61%，而在單獨(dú)褪黑素處理(MT1、MT2、MT3)下均無顯著變化。與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，各鹽與褪黑素復(fù)合處理(NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3)紫花苜蓿幼苗的根長、根鮮重和根干重均顯著增加，并以NaCl+MT2處理增幅最大，分別達(dá)到34.52%、41.93%和19.61%，同時它們的株高和葉面積也有所提高，且仍以NaCl+MT2處理增幅最大，但增幅均未達(dá)到顯著水平。可見，紫花苜蓿幼苗生長受到鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)的顯著抑制，卻未受到各濃度褪黑素的影響；各濃度褪黑素有效緩解了鹽脅迫對紫花苜蓿生長造成的傷害,并以NaCl+MT2處理效果最佳。

表1 不同濃度外源褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長相關(guān)參數(shù)的變化

2.3 褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片膜透性的影響

電導(dǎo)率代表植物細(xì)胞的通透性，是衡量植物耐鹽性的重要指標(biāo)，而丙二醛(MDA)是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，反映了膜脂過氧化的程度，這兩指標(biāo)可以間接反映植物膜系統(tǒng)的損傷程度和抗逆性[16]。由圖2可知，與對照相比，紫花苜蓿幼苗葉片MDA和相對電導(dǎo)率在各濃度外源褪黑素單獨(dú)處理下大多無顯著變化，而在單獨(dú)鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)下均大幅顯著增加；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，鹽和褪黑素復(fù)合處理紫花苜蓿葉片MDA含量和相對電導(dǎo)率均顯著降低，并以NaCl+MT3處理的相對電導(dǎo)率和NaCl+MT2處理的MDA含量最低，它們分別比單獨(dú)鹽脅迫處理顯著降低了31.84%和30.24%，但各復(fù)合處理間均無顯著差異(圖2，Ⅰ、Ⅱ)。以上結(jié)果表明，鹽脅迫顯著增加了紫花苜蓿細(xì)胞膜系統(tǒng)的透性和膜脂過氧化程度，而施加外源褪黑素可以有效緩解鹽脅迫下細(xì)胞膜損傷的程度。

圖2 外源褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量(MDA)的變化Fig.2 Effect of exogenous melatonin on relative electrolyte leakage and MDA content in leaves of alfalfa seedling under salt stress condition

2.4 褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片相對含水量和脯氨酸的影響

葉片相對含水量反映了植物在脅迫條件下的葉片水分狀況和存活能力。與對照相比，紫花苜蓿幼苗葉片相對含水量在單獨(dú)鹽脅迫處理下顯著降低，而在單獨(dú)褪黑素處理下均無顯著變化；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，鹽和褪黑素復(fù)合處理(NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3)幼苗葉片的相對含水量均顯著增加，增幅分別為17.05%、15.27%、11.85%，但仍顯著低于對照(圖3，Ⅰ)；同時，紫花苜蓿幼苗葉片的脯氨酸含量在單獨(dú)鹽脅迫后比對照大幅度顯著增加，而在單獨(dú)褪黑素處理后較對照有一定程度的提高，但未達(dá)到顯著水平；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，紫花苜蓿幼苗葉片的脯氨酸含量在鹽和褪黑素復(fù)合處理下均顯著大幅降低，NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3處理分別顯著降低了43.99%、48.35%、37.72%，但各復(fù)合處理間無顯著差異(圖3，Ⅱ)?？梢姡}脅迫顯著降低了紫花苜蓿幼苗葉片相對含水量，卻顯著提高了其脯氨酸含量；單獨(dú)褪黑素處理對幼苗葉片相對含水量和脯氨酸含量均無顯著影響；外源褪黑素處理可顯著提高鹽脅迫幼苗葉片的相對含水量，卻顯著降低其脯氨酸含量，表明褪黑素不僅可以有效緩解鹽脅迫下細(xì)胞失水危害，也可緩解鹽脅迫下細(xì)胞膜的過氧化程度。

圖3 外源褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片相對含水量和脯氨酸含量的變化Fig.3 Effect of exogenous melatonin on relative water content and proline content in leaves of alfalfa seedling under salt stress condition

2.5 褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片抗氧化物酶活性的影響

許多研究發(fā)現(xiàn)，與O2相比，部分還原或活化的氧衍生物具有高度的活性和毒性，并能導(dǎo)致細(xì)胞的氧化傷害，這是好氧生物發(fā)展出高效的活性氧(ROS)清除機(jī)制的必然結(jié)果[17-19]，ROS的清除機(jī)制是植物耐鹽機(jī)制的重要組成部分。圖4顯示，在單獨(dú)鹽脅迫處理(NaCl)和褪黑素處理(MT1、MT2、MT3)下，紫花苜蓿幼苗葉片過氧化物酶(POD)、抗氧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性大多顯著高于對照；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，鹽和褪黑素復(fù)合處理(NaCl+MT1、NaCl+MT2、NaCl+MT3)幼苗葉片的POD活性分別顯著提高25.66%、31.45%、30.47%，SOD活性分別顯著提高38.04%、41.41%、39.74%，而它們的CAT活性也有增加的趨勢，但均未達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果說明，在鹽脅迫條件下，外源褪黑素可誘導(dǎo)紫花苜蓿幼苗葉片POD、SOD活性顯著增強(qiáng)，提高其活性氧的清除能力，減輕鹽脅迫誘導(dǎo)的過氧化傷害。

圖4 外源褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片抗氧化物酶活性的變化Fig.4 Effect of exogenous melatonin on antioxidant enzyme activities in leaves of alfalfa seedling under salt stress condition

2.6 褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片光合作用指標(biāo)的影響

與其他細(xì)胞器相比，葉綠體對鹽脅迫更敏感[20]，鹽分對光合作用的影響主要表現(xiàn)在抑制CO2向葉綠體的擴(kuò)散和葉片光化學(xué)的改變[21]。圖5顯示，在單獨(dú)鹽脅迫條件下，紫花苜蓿幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率較對照分別顯著下降了25.62%、36.25%和32.91%；MT2和MT3處理的凈光合速率、MT2處理的氣孔導(dǎo)度均顯著高于對照，而MT1處理的蒸騰速率顯著低于對照，其余單獨(dú)褪黑素處理光合參數(shù)均與對照無顯著差異；與單獨(dú)鹽脅迫處理相比較，鹽和褪黑素復(fù)合處理葉片的各光合參數(shù)均顯著提高，并均以NaCl+MT2處理增幅最高，增幅分別為30.27%、45.1%、42.15%，但各復(fù)合處理之間多無顯著差異。以上結(jié)果表明，鹽脅迫顯著抑制了紫花苜蓿幼苗光合作用，施加外源褪黑素可有效緩解鹽脅迫造成的危害，對提高鹽脅迫環(huán)境下植株的光合作用起著至關(guān)重要的作用。

圖5 外源褪黑素對鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率的變化Fig.5 Effect of exogenous melatonin on net photosynthetic rate, stomatal conductance and transpiration rate of alfalfa seedling under salt stress condition

3 討論與結(jié)論

紫花苜蓿作為天然的優(yōu)質(zhì)牧草，鹽分是限制其正常生長的非生物脅迫因子之一。王曉春等[22]研究表明，低濃度(0.2%)鹽對多數(shù)苜蓿種子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)鹽濃度為 0.8% 時，畸形苗開始出現(xiàn)，且根長明顯縮短，1.2%的鹽濃度是紫花苜蓿耐鹽的極限濃度；‘中苜1號’在150 mmol/L(約0.88%)鹽處理后，根長迅速下降，且萌發(fā)率也大幅降低[23]。本研究也表明150 mmol/L NaCl可作為‘中苜1號’鹽脅迫實(shí)驗(yàn)的最佳濃度。褪黑素是一種在植物進(jìn)化過程中高度保守的胺類激素，其在植物中既是一種多效性的信號分子，又是一種有效的抗氧化分子[24]，褪黑素具有劑量依賴性，最佳濃度的褪黑素具有抗環(huán)境脅迫的作用，但不同植物的最適濃度不同。Shakeel的研究發(fā)現(xiàn)，60 μmol/L的外源褪黑素顯著提高了鹽脅迫下玉米的生長、葉綠素含量、光合效率和抗氧化酶活性，降低了體內(nèi)活性氧(ROS)水平[25]。施用外源褪黑素能有效促進(jìn)金盞菊幼苗對鹽脅迫的適應(yīng)性，以 100 μmol/L 褪黑素處理效果最好[26]。本研究發(fā)現(xiàn)緩解紫花苜蓿幼苗鹽脅迫危害的外源褪黑素最佳濃度為50 μmol/L。

已有研究表明，外源褪黑素能提高某些植物的耐鹽性。本試驗(yàn)表明，褪黑素通過改善鹽脅迫對幼苗生長特性的抑制作用，有效地提高了幼苗對鹽脅迫的適應(yīng)性。Ahmad[25]和Cen[11]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素都顯著減弱了鹽脅迫對玉米幼苗生長指標(biāo)的抑制作用，本研究進(jìn)一步證實(shí)了前人的研究結(jié)果。已有研究表明，褪黑素誘導(dǎo)根系生長受生長素調(diào)節(jié)生理過程的調(diào)控，影響根系對水分的吸收，啟動細(xì)胞壁不可修復(fù)的延伸[27]。本研究結(jié)果與前人在鹽脅迫條件下施用褪黑素增加油菜種子根長的研究結(jié)果一致[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下施加外源褪黑素處理與單獨(dú)鹽脅迫處理相比，紫花苜蓿幼苗的根長和根鮮重分別顯著增加了34.52%和41.93%，增加幅度明顯比其他生長指標(biāo)更大，這可能與本研究通過水培根灌法將褪黑素直接作用于紫花苜蓿幼苗根部相關(guān)。光合作用是植物一項重要的生理功能[29]，在鹽脅迫下植物的一個重要反應(yīng)是關(guān)閉氣孔以減少水分的損失，從而限制了光合作用，已有眾多研究表明褪黑素可緩解鹽脅迫對光合作用的抑制作用[25,30]。本研究結(jié)果也表明外源褪黑素使得紫花苜蓿幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率較鹽脅迫處理都顯著增加，有效緩解了鹽脅迫對光合作用的抑制程度。因此，適量施用外源褪黑素可以有效改善氣孔的功能，使植物在鹽脅迫下重新打開氣孔，對氣孔限制的緩解有助于鹽脅迫下光合作用的增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理下，紫花苜蓿幼苗葉片丙二醛和相對電導(dǎo)率都顯著增加，而施加外源褪黑素可以顯著降低這兩個指標(biāo)的增幅，有效緩解鹽脅迫下膜損傷的程度，維持植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。同樣，外源褪黑素處理可顯著降低鹽脅迫下月季葉片的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量[31]。前人研究表明，外源褪黑素也可以減輕鹽脅迫條件下小麥幼苗的水分損失[32]；本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下施加褪黑素提高了紫花苜蓿幼苗葉片相對含水量，減輕水分損失；并有效改善了鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片脯氨酸含量，這與李紅杰的研究結(jié)果相似[30]。有研究表明，褪黑素具有兩親性，能進(jìn)入亞細(xì)胞部分，使其具有更強(qiáng)的抗氧化作用；除此之外，與褪黑素相關(guān)的代謝產(chǎn)物也具有抗氧化作用，能夠減輕由非生物脅迫引起的活性氧的產(chǎn)生以及增加抗氧化物酶活性[33]。在本研究中，施加外源褪黑素顯著增強(qiáng)了鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片POD和SOD活性，而其CAT活性雖有增加趨勢，但增幅未達(dá)到顯著水平。在眾多研究中，外源褪黑素處理都顯著提高了以上3個抗氧化酶的活性，從而增強(qiáng)了植株活性氧的清除能力[11,25,30-31]。因此，應(yīng)用褪黑素可以降低鹽介導(dǎo)的活性氧對紫花苜蓿幼苗的有害影響，提高植物對逆境的抗性。

綜上所述，在鹽脅迫條件下，紫花苜蓿幼苗葉片抗氧化物酶活性顯著降低，活性氧的積累增加，細(xì)胞膜質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞，膜透性增加，植株光合作用效率以及生長受到顯著抑制。外源褪黑素處理可顯著提高鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗體內(nèi)POD和SOD活性，從而減少ROS的積累，顯著降低MDA含量和相對電導(dǎo)率，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)活性，最終顯著提高了紫花苜蓿幼苗的光合作用效率，促進(jìn)植株生長，從而表現(xiàn)出一定的耐鹽脅迫能力。在本研究的150 mmol/L NaCl脅迫條件下，施用50 μmol/L外源褪黑素最有利于緩解紫花苜蓿幼苗受到的鹽脅迫傷害，顯著增強(qiáng)其耐鹽性，對植株生長產(chǎn)生積極影響。