定向誘導為神經元樣細胞的間充質干細胞對大鼠坐骨神經損傷的修復作用及生物力學評價

胡安全　　王正安　　秦力　　李哲　　馮祁軍

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞;神經元樣細胞;坐骨神經損傷;生物力學;神經修復

[中圖分類號] R329.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）15-0027-05

Repairing effects and biomechanical evaluation of mesenchymal stem cells induced into neuron-like cells on sciatic nerve injury in rats

HU Anquan? ?WANG Zheng′an? ?QIN Li? ?LI Zhe? ?FENG Qijun

Department of Orthopedics， the First Hospital of Jiaxing in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] Objective To research the repairing effects and biomechanical evaluation of mesenchymal stem cells （BM-MSCs） induced into neuron-like cells on sciatic nerve injury in rats. Methods The purified rat BM-MSCs were obtained in vitro， and the BM-MSCs were differentiated into neuron-like cells by β-mercaptoethanol inducer. A total of 80 SD rats were divided into the sham operation group， the model group， the normal cell group and the directional induction group. Excepted the sham operation group， the other three groups were used to establish rat sciatic nerve crush injury models. In rats of the normal cell group and the directional induction group， BM-MSCs or neuron-like directional differentiation BM-MSCs were injected into the sciatic nerve injury respectively. The sham operation group and the model group were injected with the same dosage of normal saline. The sciatic nerve function index （SFI） was measured， the motor function of rats was evaluated by Bsso-Beattie-Bresnahan（BBB） scoring method， and its biomechanics was evaluated by electrophysiological examination of sciatic nerve and unidirectional stretching test of sciatic nerve. The expression levels of brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， myelin basic protein （MBP） and growth-associated protein 43 （GAP-43） in neurogenic encephalopathy were detected by Western blot method. Results Compared with the sham operation group， the SFI index and BBB score of sciatic nerve in rats of the model group were all decreased， the expression levels of BDNF， MBP and GAP-43 protein were decreased， and the amplitude value， motor conduction velocity， maximum stress， maximum strain， elastic limit stress and elastic limit strain were also decreased significantly（all P<0.05）. However， compared with the model group， the above-mentioned indexes in the normal cell group and the directional induction group were increased， especially in the directional induction group （all P<0.05）. Conclusion BM-MSCs induced into neuron-like cells have obvious repairing effects on sciatic nerve injury in rats.

[Key words] Bone marrow mesenchymal stem cells; Neuron-like cells; Sciatic nerve injury; Biomechanics; Nerve repairing

外傷性周圍神經損傷是一種重要的臨床和公共衛生問題[1]，尤其以臀部坐骨神經損傷最難處理且預后最差[2]。這與周圍神經系統的再生和修復能力有限有關，易導致與之相關的器官結構和功能的永久性損傷[3]。近年來，骨髓間充質干細胞（Bone marrow stromal stem cells，BM-MSCs）已被用作Schwann細胞的替代品，在治療周圍神經損傷方面顯示出巨大的潛力[4]。劉峰等[5]研究表明，在特定誘導劑的作用下，骨髓間充質干細胞在體外亦可定向向神經細胞分化。因此，本研究將大鼠骨髓間充質干細胞在體外定向誘導為神經元樣細胞，繼而回植入大鼠體內，研究其對大鼠坐骨神經損傷的治療作用及機制，以期為坐骨神經損傷的治療提供新的治療方法及依據。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑

MODEL55100電子萬能自動控制試驗機購自中國長春試驗機研究所;MedlecSynergy型肌電圖儀購自英國Oxford儀器公司;小動物手術顯微鏡和非吸收尼龍縫線（帶針）購自上海玉研科學儀器有限公司;免疫印跡一抗腦源性神經營養因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、髓磷脂堿性蛋白（Myelin basic protein，MBP）與和生長關聯蛋白43（Growth associated protein-43，GAP-43）購自英國Abcam公司。

1.2大鼠BM-MSCs提取、鑒定及向神經元樣細胞定向誘導分化

取4只健康成年SD大鼠雙側后腿，解剖股骨和脛骨，用無菌的DMEM/F12完全培養基反復沖洗骨髓腔，直至骨骼變白。經常規細胞貼壁篩選法及多次傳代在體外進行純化后獲得大鼠BM-MSCs，經流式細胞術檢測間充質干細胞標志分子CD29、CD44、CD90以及造血細胞標志物CD45的表達情況。將獲得的BM-MSCs接種于培養板中，待細胞鋪滿孔底達90%時，吸棄培養基。用化學誘導劑β-巰基乙醇誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經細胞，檢測神經元特異性烯醇化酶陽性細胞的陽性率，將獲得的神經元樣細胞用于后續動物實驗。

1.3動物分組與模型建立

84只（包含4只用于提取BM-MSCs，余80只大鼠進行實驗分組）成年健康SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠購自中國醫科大學實驗動物中心[（動物許可證號：SCXK（遼）2018-0004）]，雌雄不限，實驗過程得到我院動物實驗倫理委員會批準，并遵守國家研究委員會護理和使用實驗動物的指南（1996年修改）。隨機分為假手術組、模型組、普通細胞組與定向誘導組。用鉗夾坐骨神經的方法構建大鼠單側坐骨神經損傷模型[6]。3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，剃毛備皮，常規消毒固定。無菌條件下取左股后上部縱形切口，自股二頭肌與半腱肌、半膜肌間鈍性分離，充分暴露坐骨神經，在坐骨結節下方0.5 cm處，鉗夾10 s，反復3次，造成3 mm的損傷區，手術過程中，顯微鏡觀察到其外膜連續而神經軸突中斷。依次縫合肌肉皮膚，消毒后常規飼養。術后次日，分別將未做任何誘導分化處理的BM-MSCs（約1×106個細胞）和誘導分化成功的神經元樣細胞（約1×106個細胞）植入普通細胞組和定向誘導組大鼠坐骨神經損傷處。另外假手術組和模型組大鼠分別給予等量（1 mL）生理鹽水。

1.4坐骨神經功能指數（Sciatic function index，SFI）評分[6]

分別于術后第2、4、8、12周進行坐骨神經功能指數測定。自制長90 cm、寬 15 cm、高 20 cm的大鼠足行走箱。箱底放置寬15 cm的連續記錄紙。大鼠雙后足蘸炭素墨水后放入行走箱入口，大鼠在向遠端爬行過程中每側留4～5個足印，選實驗側肢（E）和健側肢（N）足印，測量以下變量：足印長度（Paw length，PL）=足跟到足尖的距離;足趾寬度（Toe spread，TS）=第一趾到第五趾連線的距離;中間足趾距離（IT）=第二趾到第四趾連線的距離。將上述三個變量代入Bain公式計算SFI，以SFI=0為正常值，-100為神經完全斷離指標。SFI=-38.3×（EPL-NPL）/NPL+109.5×（ETS-NTS）/NTS+13.3×（EIT-NIT）/NIT-8.8。

1.5大鼠運動功能評價

每次觀察4 min內各組大鼠的運動情況，兩位經驗豐富的觀察者獨立地使用Bsso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分標準[7]對大鼠運動情況進行打分，分值范圍0分（無自發運動）～21分（運動正常）。在手術前記錄1次BBB評分，以建立基線對照。手術后每間隔7 d記錄1次各組大鼠BBB評分，連續記錄12周。

1.6電生理檢測

術后12周，大鼠用10%水合氯醛麻醉，俯臥在自制手術臺上，暴露左、右側坐骨神經干。

安裝兩個接地電極-單極直針電極（26G）和螺旋電極。直針電極插入鄰近肌肉組織內，螺旋電極定位于神經周圍。高頻濾波器設置為5 kHz，低頻濾波器設置為2 Hz。對每一個所獲得的電位（復合神經動作電位和復合肌肉動作電位），刺激為方形電脈沖（持續時間0.04 ms，電流20 mA，6個連續刺激），誘發出動作電位波幅及潛伏期。由兩個刺激點之間的距離除以不同的傳導時間計算神經傳導速度。

1.7單向拉伸實驗[8]

10%水合氯醛麻醉大鼠后，在神經吻合處的中點取各組大鼠的兩側坐骨神經（長約20 mm），大鼠右側坐骨神經為正常對照組。取出坐骨神經后，在麻醉狀態下斷頭處死大鼠。室溫下將每個坐骨神經試樣安裝到試驗機拉伸夾頭中，以1.5 mm/min的增加速度對坐骨神經試樣施加拉伸載荷。

1.8蛋白免疫印跡法（western blot）

將收集的坐骨神經組織在液氮中研磨成粉后，用RIPA細胞裂解液提取各組大鼠坐骨神經總蛋白，取各蛋白樣品于10%聚丙烯酰胺凝膠中設置80 V（1.5 h）/100 V（0.5 h）電壓電泳。將蛋白條帶轉至聚偏二氟乙烯膜上后用5%的牛血清白蛋白封閉2 h。分別加入BDNF、MBP與和GAP-43蛋白抗體孵育過夜。再用山羊抗兔IgG二抗孵育2 h后顯影，最后以β-actin作為內標對蛋白條帶進行半定量分析。

1.9統計學處理

應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），再采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 BM-MSCs提取、鑒定及向神經元樣定向誘導分化

置于倒置光學顯微鏡下觀察，大鼠BM-MSCs呈典型的長梭形，排列整齊，旋渦樣生長。經流式細胞術鑒定，培養P3代的BM-MSCs高表達CD29（98.35±0.14）%、CD44（98.53±0.08）%、CD90（97.31±0.15）%，幾乎不表達CD45（1.05±0.03）%。然后用化學誘導劑β-巰基乙醇誘導大鼠BM-MSCs向神經元樣定向分化，誘導7 d后，細胞逐漸向神經元樣細胞形態分化，出現軸突樣類似物，細胞體收縮，遮光性增強。神經元特異性烯醇化酶陽性細胞的陽性率為（39.75±3.34）%，故可用于后續試驗。見封三圖4。

2.2定向誘導為神經元樣細胞的BM-MSCs對SFI的影響

術后2、4、8、12周時，模型組大鼠SFI顯著低于假手術組，而定向誘導組大鼠SFI一直高于模型組、普通細胞組（均P<0.05）。見表1。

2.3 定向誘導為神經元樣細胞的BM-MSCs對BBB評分的影響

與假手術組相比，模型組大鼠術后12周各時間點的BBB評分均顯著降低;但是與模型組相比，普通細胞組和定向誘導組大鼠各時間點BBB評分均顯著升高，尤其是定向誘導組大鼠各時間點BBB評分高于普通細胞組（均P<0.05）。

2.4定向誘導為神經元樣細胞的BM-MSCs對電生理測定結果的影響

與假手術組相比，模型組大鼠波幅值和運動傳導速度值均顯著降低;但是與模型組相比，普通細胞組和定向誘導組大鼠波幅值和運動傳導速度值均顯著升高，尤其是定向誘導組大鼠波幅值和運動傳導速度值高于普通細胞組（均P<0.05）。

2.5定向誘導為神經元樣細胞的BM-MSCs對拉伸實驗結果的影響

與假手術組相比，模型組大鼠坐骨神經最大應力、最大應變、彈性限度應力、彈性限度應變均顯著降低;但是與模型組相比，普通細胞組和定向誘導組大鼠坐骨神經最大應力、最大應變、彈性限度應力、彈性限度應變均顯著升高，尤其是定向誘導組大鼠坐骨神經最大應力、最大應變、彈性限度應力、彈性限度應變高于普通細胞組（均P<0.05）。

2.6定向誘導為神經元樣細胞的BM-MSCs對BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達的影響

與假手術組相比，模型組大鼠坐骨神經BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達量均顯著降低;但是與模型組相比，普通細胞組和定向誘導組大鼠坐骨神經BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達量均顯著升高，尤其是定向誘導組大鼠坐骨神經BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達量高于普通細胞組（均P<0.05）。

3 討論

坐骨神經是由L4～5和S1～3神經根組成[9]。臨床上坐骨神經常由于擠壓、壓迫、拉伸、撕脫和分裂而受損，多見于腰椎間盤突出癥、梨狀肌綜合征、髖關節脫臼或骨盆骨折等[10]。坐骨神經損傷是生活中常見的疾病，當坐骨神經受傷后，患者患肢顯示疼痛相關的步態和腫脹，不僅影響到正常行走，也會導致腿部的肌肉喪失功能。盡管坐骨神經修復技術不斷改進，但單純外科手術的治療效果仍差強人意。這主要是由于坐骨神經組織再生能力差，損傷后局部微環境不利于軸突生長，以及損傷部位膠質瘢痕的形成等原因[11]。為了使損傷的坐骨神經恢復到損傷前的水平，研究人員做了大量的研究，如同種異體神經移植，但是移植后的排除反應不可避免[12]。

近年來，基于BM-MSCs的治療已經成為促進神經再生的一種十分有前途的治療方法。BM-MSCs可以從脂肪、臍帶血，胚胎以及骨髓中獲得[13]。它們具有分化為骨髓基質細胞、脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、心肌細胞以及神經細胞的潛能，故而可用于再生細胞治療[14]。在本研究中利用常規細胞貼壁篩選法及多次傳代獲得純化的大鼠BM-MSCs，置于倒置光學顯微鏡下觀察，大鼠BM-MSCs呈典型的長梭形，排列整齊，旋渦樣生長。經流式細胞術鑒定，培養P3代的BM-MSCs高表達CD29、CD44、CD90，幾乎不表達CD45。BM-MSCs因具備橫向分化潛能，在神經營養因子誘導作用下，少部分BM-MSCs在體內可分化為神經外胚層樣細胞，但是仍有大部分BM-MSCs分化為星形膠質細胞。因此在應用BM-MSCs時，在體外成功將其定向分化的技術將至關重要，這在很大程度上會影響疾病的治療效果。目前，國內外學者將BM-MSCs定向誘導分化成神經元樣細胞的方法主要包括化學誘導法（β-巰基乙醇，全反式視黃酸）、神經生長因子誘導法、Transwell小室共培養等。β-巰基乙醇是研究較早且較為成熟的一種分化誘導劑，通過提高胞質內抗氧化成分-谷胱甘肽的水平降低氧自由基的生成量以達到誘導細胞分化的目的。關寧等[22]曾比較β-巰基乙醇和神經生長因子誘導BM-MSCs向神經細胞分化的可行性，結果證實，β-巰基乙醇組神經元特異性烯醇化酶陽性率和微管相關蛋白分化率更高，說明相較于神經生長因子，β-巰基乙醇能夠更好地促進BM-MSCs向神經元樣細胞分化。基于此，本研究利用化學誘導劑β-巰基乙醇誘導大鼠BM-MSCs向神經元樣定向分化，誘導7 d后，細胞逐漸向神經元樣細胞形態分化，出現軸突樣類似物，細胞體收縮，遮光性增強。神經元特異性烯醇化酶陽性細胞的陽性率超過90%，說明神經元樣定向誘導分化較為成功，進而將定向誘導分化的BM-MSCs注射入模型大鼠的坐骨神經損傷處，另外設置普通BM-MSCs對照組。觀察12周后，證實普通細胞組和定向誘導組大鼠運動功能較模型組大鼠明顯改善，利用電生理檢測和拉伸實驗也證實，無論是注射BM-MSCs還是注射神經元樣定向誘導分化的BM-MSCs，均具有恢復大鼠坐骨神經電生理學特性和拉伸力學性能的作用。而且坐骨神經損傷處神經生長相關因子（BDNF、MBP、GAP-43蛋白）的表達水平明顯升高。尤其是定向誘導組大鼠較普通細胞組大鼠SFI指數、BBB評分、坐骨神經電生理學特性和拉伸力學性能改善更明顯，且BDNF、MBP、GAP-43蛋白表量更高，說明BM-MSCs可以向神經損傷點傳遞有助于功能恢復的關鍵信號，進而改變細胞行為或轉移某些細胞因子以減輕損傷。而且神經元樣定向誘導分化的BM-MSCs更有利于坐骨神經損傷的恢復。

既往雖然眾多基礎研究證實，靜脈注射BM-MSCs可以調節局部環境，減少炎癥反應，促進小鼠坐骨神經擠壓模型軸突再生[15];同時也可增加新生神經纖維和神經血管的數量，進而促進損傷的周圍神經功能的恢復[16]。例如龔慶等[17]的研究顯示分化的骨髓間充質干細胞植入外周神經斷端時，可以促進神經纖維的再生，其作用機制與骨髓間充質干細胞移植促進周圍神經損傷中的軸索再生與營養物質的產生有關聯。但是隨著研究的深入，越來越多的體內實驗發現，體內移植后BM-MSCs向膠質細胞和成纖維細胞分化的比率高于向神經元樣細胞分化的比率[18]。以BM-MSCs為基礎的坐骨神經損傷治療有兩個主要目的，一是為神經元細胞提供微環境，以支持或增強損傷處細胞的神經保護和再生能力;二是替換丟失或受損的神經元。以往的許多研究表明，移植的BM-MSCs可促進神經營養因子的分泌進而對周圍神經元再生起重要作用。然而誘導BM-MSCs向神經元樣定向分化也是十分重要的。因此在本研究中，首先在體外利用化學誘導劑將BM-MSCs向神經元定向誘導，再注射至動物坐骨神經損傷處，并得到了較為理想的治療效果。

GAP-43是一種熱穩定的磷酸蛋白，當神經受到損傷時GAP-43表達開始升高，能夠幫助受損傷的神經再生、發育并加快結構重建[19]。BDNF是一種促進中樞神經系統神經元增殖和存活的分泌生長因子，其與神經元可塑性和神經遞質調節有關。MBP是中樞神經系統髓鞘中含量第二豐富的蛋白，負責致密多層髓鞘的細胞質表面的黏附[20]。作為“內在無序”或構象適應性蛋白家族的一員，它可以與肌動蛋白、微管蛋白、網格蛋白等多陰離子蛋白以及帶負電荷的脂質相互作用，并通過與它們結合而獲得結構[21]。Western blot實驗結果表明定向誘導為神經元樣細胞的BM-MSCs可以上調坐骨神經損傷大鼠坐骨神經組織中BDNF、MBP和GAP-43蛋白表達，說明將BM-MSCs進行神經元樣定向誘導分化處理后，更有利于大鼠坐骨神經的恢復，其可能的作用機制之一與BM-MSCs產生多種細胞因子，如BDNF、MBP、GAP-43等有關。

隨著社會的發展、交通事故傷害的增加，坐骨神經損傷的發生率日漸增高，我們的研究證明定向誘導為神經元樣細胞的BM-MSCs對大鼠坐骨神經損傷具有明顯的修復效果，這為坐骨神經損傷的治療提供了新的方向，并為最終過渡到臨床應用提供強有力的實驗依據。

[參考文獻]

[1] Checchia GA，Maruro GL，Morico G，et al.Observational multicentric study on chronic sciatic pain：Clinical data from 44 Italian centers[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017， 21（7）：1653-1664.

[2] Coluzzi F，Fornasari D，Pergolizzi， J，et al.From acute to chronic pain：Tapentadol in the progressive stages of this disease entity[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（7）：1672-1683.

[3] Jiang J，Zhang Z，Yu Y，et al.Screening of NogoA/NTR-related differential genes in rat sciatic nerve injury signal pathway[J].Per Med，2019，16（2）：93-105.

[4] Fu X，Liu G，Halim A，et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair[J].Cells，2019，8（8）：784.

[5] 劉峰，李曉飛，劉艷.慢病毒介導髓細胞觸發受體2過表達質粒轉染促進人骨髓間充質干細胞向神經細胞分化[J].解剖科學進展，2020，26（5）：570-574.

[6] 王澤穆，宋清清，周波，等.鼠神經生長因子治療大鼠坐骨神經損傷的療效[J].江蘇醫藥，2019，45（12）：1193-1196，1184.

[7] 姚陽，車敏，滕松齡，等.重組水蛭素對大鼠坐骨神經損傷后神經功能的影響及可能機制[J].解剖科學進展，2020， 26（1）：86-89.

[8] 吳志峰，羅民.化學去細胞異體神經聯合骨髓間充質干細胞修復損傷坐骨神經的生物力學評價[J].中國組織工程研究，2020，24（7）：991-995.

[9] Micke O，Seegenschmiedt MH，Adamietz IA，et al.Low-dose radiation therapy for benign painful skeletal disorders：The typical treatment for the elderly patient？[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2017，98（4）：958-963.

[10] 佟欣鑫，馬鐵明.坐骨神經損傷分類及常用模型制造[J].按摩與康復醫學，2018，28（8）：8-10.

[11] 付秀美，楊海艷，王榮良，等.脂肪源性干細胞促進大鼠受損坐骨神經傳導及脊髓腦源性神經營養因子和睫狀神經營養因子的表達[J].解剖學雜志，2017，40（1）：11-15.

[12] Hervera A，De Virgiliis F，Palmisano I，et al.Reactive oxygen species regulate axonal regeneration through the release of exosomal NADPH oxidase 2 complexes into injured axons[J].Nat Cell Biol，2018，20（3）：307-319.

[13] 張德綢，葛建華，吳昭君.自體富血小板血漿對周圍神經損傷修復微環境影響的的實驗研究[J].四川醫學，2018，39（8）：846-850.

[14] Wang Y，Li ZW，Luo M，et al. Biological conduits combining bone marrow mesenchymal stem cells and extracellular matrix to treat long-segment sciatic nerve defects[J].Neural Regen Res，2015，10（6）：965-971.

[15] 龔慶，宋秋瑩，邱莉晶，等. PLGA微球搭載鹿茸多肽聯合BMSCs移植對坐骨神經損傷修復的作用及機制研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（11）：1296-1300.

[16] Lima Giacobbo B，Doorduin J，Klein HC，et al.Brain-derived neurotrophic factor in brain disorders：Focus on neuroinflammation[J].Mol Neurobiol，2019，56（5）：3295-3312.

[17] 龔慶，宋秋瑩，邱莉晶，等.聚丙交酯-乙交酯微球搭載鹿茸多肽聯合骨髓間充質干細胞對大鼠坐骨神經損傷的修復作用及其機制[J].吉林大學學報（醫學版），2018，44（6）：1174-1178.

[18] 程光，王梅，劉愛華.AAV介導NGF過表達載體轉染BMSCs對高強度聚焦超聲致活體SD大鼠坐骨神經損傷模型保護作用[J].社區醫學雜志，2020，18（10）：721-727，731.

[19] 王天儀，原文琦，劉勇，等.坐骨神經預損傷后miR-124-3p調節GAP-43表達并促進軸突生長的實驗研究[J].中華骨科雜志，2015，22（4）：420-427.

[20] 古梓婷，賈會，賴勝敏，等.丙烯酰胺染毒對大鼠坐骨神經MBP和MAG表達的影響[J].神經解剖學雜志，2019， 35（1）：29-34.

[21] Huang R，Xiao H，Zhao J，et al.GAP-43 is involved in the orientation of cell division by interacting with GalphaI during neurogenesis[J].Int J Neurosci，2020，130（2）：144-152.

（收稿日期：2020-12-01）