基于分子對接技術篩選抗SARS-CoV-2海洋活性肽的研究

步 營，劉瑛楠，何 瑋，朱文慧，李學鵬，儀淑敏，徐永霞，勵建榮

（渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧錦州 121013）

0 引言

2019年12月，新型冠狀病毒肺炎席卷全球。SARS-CoV-2作為一種新型病毒，突兀地登上了國際熱點的舞臺，威脅人民的生命安全，影響人民的正常生活。因此現階段對于它的研究也在如火如荼的進行，例如對其的治療、疫苗的研發、保健食品的生產等。

研究發現，SARS-CoV-2與SARS-CoV同屬β型冠狀病毒類，雖然現階段SARS-CoV-2晶體結構不明，但其S蛋白RBD結構域的某些基因區域與SARS-CoV具有高度的同源性，它們的功能性受體皆為血管緊張素轉化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）［1］，致病機理相同，皆為病毒的S蛋白與宿主細胞上的ACE2受體結合，從而致使病毒入侵宿主［2］。由此，可以選擇與其同源性較高的SARS病毒的S蛋白和ACE2（即SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白）作為代替的研究對象［3-5］，進行新冠病毒抑制機理的研究。另一方面，由于2019-nCoV Mpro水解酶關系著SARSCoV-2前體蛋白的成熟，阻斷其水解酶活性表達就可抑制病毒在宿主體內的復制過程。上海科技大學饒子和/楊海濤團隊公開了2019-nCoV Mpro水解酶的高分辨率晶體結構，可以使其作為對SARS-CoV-2有抑制作用的另一研究對象，通過篩選抑制劑，有效遏制SARS-CoV-2在宿主體內的復制，阻斷其增殖過程。

我國海洋資源豐富，藍鰭金槍魚屬于大洋性中上層高度洄游魚類，是金槍魚類中經濟價值最高的種類，而經酶解處理的蛋白質水解產物具有多種生物活性功能［6］。經數據庫查詢，藍鰭金槍魚的肌球蛋白序列已知。鑒于此，本文采用計算機酶解和分子對接的方法，對藍鰭金槍魚的肌球蛋白進行模擬酶解，進而篩選對新冠病毒有抑制作用的活性肽，為進一步應用于保健食品提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍鰭金槍魚的肌球蛋白可通過蛋白質數據庫UniProt（https：//www.uniprot.org/）查 詢 得 到［7］，UniProtKB ID號為G9M5T1的，其序列為FAST格式。

SARS-CoV病毒晶體結構的PDB代碼為2AJF，選擇僅保留晶體結構中的A鏈（ACE2）和E鏈（SARA-CoV-S）作為研究對象，結構如圖1所示。2019-nCoV Mpro水解酶晶體結構的PDB代碼為6LU7，如圖2所示。

圖1 SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白的三維構型Fig.1 Three-dimensional configuration of SARS-CoV-S/ACE2 compound protein

圖2 2019-nCoV Mpro水解酶的三維構型Fig.2 Three-dimensional configuration of 2019-nCoV Mpro hydrolase

1.2 試驗方法

1.2.1 計算機虛擬酶解

運用生物信息學的方法，以肌球蛋白G9M5T1序列作為原料，并通過酶切工具Peptide Cutter（https：//web.expasy.org/peptide_cutter/）選擇pepsin ph1.3，trypsin，chymotrypsin-low specificity（C-term to［FYW］，not before P）3種酶對該蛋白進行模擬酶解［8］。

1.2.2 海洋活性肽的活性預測

使用活性預測工具 Peptide Ranker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）對海洋多肽片段的活性進行預測，從中篩選高活性（>0.5）的肽片段。

1.2.3 海洋活性肽的毒性預測

對海洋活性肽使用毒性預測工具ToxinPred（http：//crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）毒性預測，篩選無毒的海洋活性肽［9］。

1.2.4 篩選未知活性肽

使用生物活性肽數據庫Peptides HGATSearch（http：//www.peptides.be/?p=search）篩 選未知作用的海洋活性肽進行下一步的研究。

1.2.5 海洋活性肽三維結構的構建

使用 Discovery Studio 2017（DS，v17.2.016349）軟件對酶解得到的高活性且無毒的海洋活性肽序列的三維結構進行構建。在DS軟件中畫出多肽結構，對其進行“Clean Geometry”處理，得到其三維結構。

1.2.6 分子對接

分子對接是一種用來研究分子間相互作用的一種方法［10］。去除SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白和2019-nCoV Mpro水解酶的水分子和配體，并進行“Clean Protein”以及“Prepare Protein”的前處理操作。確定SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白的關鍵氨基酸分別為ACE2片段上ASP38，GLN42，GLN325，GLU329，以 及 S蛋 白 上 的 TYR436，TYR491。確定2019-nCoV Mpro水解酶的關鍵氨基酸為 THR24，THR25，THR26，LEU27，ASN28以及ASN119［11］。對30條海洋活性肽片段進行“Full Minimization”和“Prepare Ligands”的前處理操作，與處理后的SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白以及2019-nCoV Mpro水解酶分別進行Dock Ligands（LibDock）分子對接，選擇“BEST”構象，其余參數均設置為默認狀態［12］。與海洋活性肽配體對接結束后篩選結果中對接成功的化合物，選取分值（LibDockScore）最高的作為該化合物的對接結果。按照分值的大小將對接成功的配體排序，篩選與受體結合口袋中關鍵氨基酸結合作用力強的化合物，作為SARS-CoV-2與ACE2結合阻斷劑以及2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑的候選海洋活性肽［13］。

2 結果與分析

2.1 計算機模擬酶解結果

G9M5T1經trypsin模擬酶解后產生302條肽片段；經pepsin ph1.3酶解后產生369條肽片段；經chymotrypsin-low specificity （C-term to ［FYW］，not before P）酶解后產生392條肽片段。

2.2 活性預測結果

對所得到的肽片段使用Peptide Ranker工具分析，篩選活性肽，進行進一步的研究。篩選結果大于0.5的預測結果，經trypsin，pepsin ph1.3，chymotrypsin-low specificity（C-term to［FYW］，not before P）酶解得到的肽片段中分別篩選出22條、17條和42條活性肽。

2.3 毒性預測結果

使用ToxinPred工具對活性肽進行毒性預測，篩選無毒活性肽，避免有毒物質進入人體從而對人體產生毒害作用。預測結果為所有活性肽均為無毒片段。

2.4 未知活性肽篩選結果

為避免與其他已知的活性肽進行重復性研究，使用Peptides HGAT-Search數據庫對活性肽進行篩選，篩選經 trypsin，pepsin ph1.3，chymotrypsin-low specificity（C-term to［FYW］，not before P）酶解后得到的未知無毒海洋活性肽，其結果如表1所示（分別用T*，P*，C*表示）。篩選結果即為對接過程最終所用的海洋活性肽配體序列，對其進行三維結構的構建。

表1 G9M5T1酶解后得到的未知海洋無毒活性肽Tab.1 Unknown marine non-toxic active peptides obtained after G9M5T1 enzymolysis

2.5 分子對接結果

2.5.1 SARS-CoV-2與ACE2結合抑制劑篩選結果

表1中的30條海洋活性肽中的19條與SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白對接成功。氫鍵的分子作用力較大，結合作用較強，故篩選對接結果中與關鍵氨基酸以氫鍵作用相結合的10條海洋活性肽，作為潛在的對與ACE2的結合有阻斷作用的活性肽片段，結果如表2所示。該10條多肽皆與SARS-CoV-S/ACE2蛋白對接口袋中關鍵氨基酸形成氫鍵化合物，其中，C4與TYR491形成3個氫鍵，分值為144.909；C8與TYR491形成2個氫鍵，T13與GLN325形成1個氫鍵，P5與GLN325形成2個氫鍵，P6與GLU329形成2個氫鍵外，它們還與其他關鍵氨基酸形成范德華力等其他作用力，分值分別為164.154、149.265、133.059、119.918，如圖3所示。綜上所述，活性肽C4，C8，T13，P5，P6 經分子對接后與對接受體結合作用較強，分析病毒入侵宿主的機理可知，以上活性肽對SARS-CoV與ACE2的結合有潛在的強阻止作用，能阻斷S蛋白與ACE2受體結合，從而阻止SARS-CoV-2入侵宿主細胞。可進一步應用于對新型冠狀病毒肺炎的預防等過程。

表2 對SARS-CoV-2結合ACE2阻斷劑的篩選Tab.2 Screening of SARS-CoV-2 combined with ACE2 blocker

圖3 活性肽段與SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白對接平面圖Fig.3 View of active peptides docking with SARS-CoV-S/ACE2 complex protein

2.5.2 2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑篩選結果

海洋活性肽與2019-nCoV Mpro水解酶進行分子對接后，有25條活性肽成功與Mpro水解酶受體對接成功，其中18條肽片段與關鍵氨基酸以氫鍵的形式結合，結果如表3所示。其中C7，T13與 THR24，THR26，ASN119形成氫鍵，分值分別為 199.696 和 183.583；T9，P5，C8 與 THR26，ASN119形成氫鍵，分值分別為199.490、180.616和 175.280；P7、T11 與 THR24，THR26 形成氫鍵，分值 分別為 182.785和 162.997；T8與 THR24，THR25，THR26形成氫鍵，分值為177.758；P9與THR25，THR26形成氫鍵，分值為163.683。此外，這些海洋活性肽不僅與對接受體形成了多個氫鍵，還與關鍵氨基酸間形成范德華力等作用力。T3，C6與 THR26形成 2個氫鍵，且與 THR24，THR25，LEU27間形成范德華力，分值分別為163.379、156.337；C4與 THR24形成 2個氫鍵，與THR24，THR26，LEU27間有范德華力作用，分值為 150.652；P8，P6，T5，P3，T12，T10，除與關鍵氨基酸形成的氫鍵外，還與THR24，THR25，THR26，LEU27，ASN119等關鍵氨基酸間形成其他分子間作用力，分值分別為 191.320、188.958、179.405、177.136、143.197。對接結果見圖4所示。綜上所述，海洋活性肽片段 C7，T13，T9，P5，C8，P7，T11，T8，T5，P9，T3，C6，C4，P8，P6，P3，T12，T10 與受體對接后可形成較強的分子間作用力，可用作篩選2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑［14］，而抑制 2019-nCoV Mpro水解酶的活性表達可以影響SARSCoV-2前體蛋白的成熟過程，進一步影響病毒在宿主體內的復制過程［15-16］，從而抑制SARSCoV-2的表達。

表3 對2019-nCoV Mpro水解酶阻斷劑的篩選Tab.3 Screening of 2019-nCoV Mpro hydrolase blocker

3 結論

以SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白以及2019-nCoV Mpro水解酶的晶體結構為受體，與30條未知的無毒海洋活性肽進行半柔性分子對接。結果可知，海洋活性肽片段 DIAGF，NIRSF，IRIHF，ASWMIYTYSG，STHPHFVR 與 SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白受體結合緊密，是潛在的SARS-CoV-2與ACE2結合阻斷劑；海洋活性肽片段FPKASDTTF，STHPHFVR，EFLWMVIR，IRIHF，NIRSF，RSTHPHF，SFMNVK，NPPNFDK，LRMDL，GFLMR，NITGW，DIAGF，FDAKTAF，ASWMIYTYSG，NHHMFV，ILYGDFK，GGSFQTVSALFR 與 Mpro 水解酶結合作用較強，是潛在的2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑。

綜上所述，活性肽段NIRSF，STHPHFVR，DIAGF，IRIHF和ASWMIYTYSG對兩種對接受體的表達均有良好的抑制作用，是SARS-CoV-2的潛在抑制劑，可進一步應用于保健食品的開發制造。