超聲波輔助豆粕一鍋法合成氫過(guò)氧化亞油酸

蔡燕,嚴(yán)鑫,朱鎮(zhèn)東,陳婷婷,陳嬌

(南通大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 南通,226019)

脂肪氧合酶(EC 1.13.11.12 lipoxygenase,LOX)能催化氧化含順,順-1,4-戊二烯的多不飽和脂肪酸生成共軛氫過(guò)氧化脂肪酸(hydroperoxide,HPOD)[1-4]。HPOD及其衍生物可作為藥物和香料生產(chǎn)的中間體[5-7],具有較大的商業(yè)價(jià)值。LOX熱穩(wěn)定性差,而且由于脂肪酸與水不互溶,導(dǎo)致該酶催化反應(yīng)的底物濃度很低[8-12],這也是限制LOX工業(yè)化應(yīng)用的兩大瓶頸。若能開(kāi)發(fā)一條工藝簡(jiǎn)單、底物濃度高、收率高、可規(guī)模化的LOX酶催化制備HPOD的方法將具有重要的工業(yè)價(jià)值。

超聲波輻射是一種提高液-液非均相體系中傳質(zhì)效果的有用手段,能加速許多化學(xué)反應(yīng)[13],已被證明是某些酶反應(yīng)中的有用工具,可在不改變體系物理量的情況下介入反應(yīng),具有簡(jiǎn)單,廉價(jià)和綠色的優(yōu)點(diǎn)。超聲波輻射能發(fā)揮多方面作用：使底物更容易訪問(wèn)活性中心口袋,通過(guò)高空化能增加底物與酶的界面面積,減少傳質(zhì)限制,改善酶的性能等。但目前超聲波輻射在酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用并不廣泛,多集中在酶催化合成生物柴油上,可使得反應(yīng)時(shí)間明顯縮短[14-17]。在LOX酶促反應(yīng)中,底物脂肪酸與LOX酶液不混溶,超聲有望以其空穴效應(yīng)改善體系的傳質(zhì)問(wèn)題而提高催化效率,以解決氫過(guò)氧化速率較低的問(wèn)題,是一個(gè)值得探索的研究方向。目前幾乎沒(méi)有關(guān)于超聲波輻射在LOX酶促反應(yīng)中的應(yīng)用報(bào)道。

LOX廣泛存在于動(dòng)植物中,尤以新鮮大豆中活力最高。我國(guó)豆粕資源豐富,成本低廉,具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。課題組前期利用脫脂豆粕為直接催化劑,將LOX的提取、固定化和催化耦合于同一過(guò)程中,對(duì)豆油的催化氧化進(jìn)行了系統(tǒng)研究,在較高底物濃度下實(shí)現(xiàn)了較好的收率(60%)[18]。大豆油與豆粕的生物轉(zhuǎn)化不僅減少了工藝步驟,還提高了總收率。本文以亞油酸為底物,期望利用新鮮豆粕耦合超聲技術(shù)開(kāi)發(fā)一條高底物濃度下生產(chǎn)氫過(guò)氧化亞油酸(linoleic acid hydroperoxide,LA-HPOD)的新工藝。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新鮮大豆(12個(gè)品種),2019年10月,黑龍江農(nóng)科院惠贈(zèng)；亞油酸(67.1%),蘇州天然乳化劑公司贈(zèng)送；二甲酚橙、過(guò)氧化氫異丙苯,Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司。乙醇、硼酸、硼砂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醚、石油醚、氫氧化鈉,濃硫酸、硫酸鈉等其他試劑均為分析純,國(guó)藥試劑。

1.2 脫脂豆粕的制備

用蒸餾水沖洗大豆,晾干備用。豆粕去皮后,用石油醚脫脂8次,然后磨細(xì),用50目篩進(jìn)行篩分。

1.3 LA-HPOD的合成

將適量亞油酸和無(wú)水乙醇加入到空氣/液體反應(yīng)器(100 mL)中,并置于恒溫水浴。在強(qiáng)磁攪拌下加入緩沖液,使混合物乳化。之后,將O2(15 mL/min)引入反應(yīng)體系中。5 min后加入適量脫脂豆粕開(kāi)始反應(yīng)。滴入1 mol/L H2SO4至pH 3停止酶反應(yīng)。用乙醚(3×體積)萃取LA-HPOD。通過(guò)水洗滌乙醚提取物來(lái)去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。LA-HPOD經(jīng)硫酸鈉干燥、乙醚蒸發(fā)后,用乙醇稀釋以進(jìn)一步測(cè)定摩爾數(shù)。所用緩沖溶液由0.2 mol/L磷酸鈉(pH 5～8)和0.2 mol/L硼酸鈉(pH 9～10)配制。

1.4 超聲輔助LA-HPOD的合成

將空氣/液體反應(yīng)器(100 mL)固定在在超聲波清洗機(jī)的中心。超聲波清洗儀的功率為100 W,頻率為40 kHz。超聲波浴容量為9.1 L,內(nèi)部尺寸為27 cm×21 cm×16 cm。浴液溫度可保持在±1 ℃內(nèi)。

1.5 脂氧合酶活性測(cè)定

每隔一段時(shí)間從充分混合的反應(yīng)介質(zhì)中吸取0.3 mL小樣,以監(jiān)測(cè)氫過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中LOX活性的變化。將取出的小樣反應(yīng)液在15 000 r/min下離心5 min。吸取20 μL上清液,用pH 9硼酸鹽緩沖液稀釋至25 mL,進(jìn)一步測(cè)定脂氧酶活性。1個(gè)單位的LOX酶活力定義為在234 nm處,1 min內(nèi),3 mL的脂氧酶液反應(yīng)增加0.001光密度的活性[19]。

1.6 LA-HPOD的定量分析

用二甲酚橙法測(cè)定LA-HPOD的摩爾量。該指示劑由113 μmol/L二甲酚橙、250 μmol/L六水硫酸鐵銨、25 mmol/L硫酸和4 mmol/L 2,6-叔丁基-4-甲基苯酚在V(甲醇):V(水)=9:1中組成。在加入甲醇-水后立即加入H2SO4,顯色45 min,在590 nm處測(cè)定吸光度。由于甲基橙的靈敏度隨著時(shí)間的增加而降低,所以通常需要當(dāng)天配制后使用。采用氫過(guò)氧化異丙苯的新鮮溶液來(lái)繪制甲基橙的校準(zhǔn)曲線[20]。通過(guò)比較測(cè)定的產(chǎn)品中LA-HPOD實(shí)際摩爾數(shù)與反應(yīng)的理論平衡產(chǎn)物數(shù),LA-HPOD的產(chǎn)率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中:N,反應(yīng)混合物中檢測(cè)到的LAHPOD摩爾量,mol；m,亞油酸的初始質(zhì)量,g；M,亞油酸的分子質(zhì)量,g/mol；原料中亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.1%,其余為油酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆品種的篩選

豆科植物種子如大豆、蠶豆等中富含脂氧酶,特別是從大豆中提取的脂氧酶活性較高。大豆中的蛋白含量為40%左右,成熟種子中脂氧酶占總蛋白的1%～2%,是大豆中比較活躍的酶。但是不同種類大豆中的脂氧酶活性差異尚未知曉。本實(shí)驗(yàn)以酶活性為衡量指標(biāo),從12種大豆中篩選出脂氧酶活力較高的品種用于后續(xù)研究。由圖1可知,各種大豆中脂氧酶活性差異并不顯著,分布于3×104～5×104U,其中黑河38中LOX的活性最高,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同品種大豆的脂氧酶活性Fig.1 The LOX enzyme acivity of different kinds of soybean

2.2 pH和溫度的影響

溫度和pH是影響酶催化反應(yīng)的兩大因素,它們對(duì)LA-HPOD產(chǎn)率的影響曲線如圖2所示。在1.5 g亞油酸,1 g豆粕體系中,以0.5 mL乙醇作助溶劑,分散在7.5 mL緩沖液中反應(yīng)2.5 h。LOX穩(wěn)定性差,低溫下活性更高,通常在0～5 ℃進(jìn)行脂氧合反應(yīng),但較高的溫度有利于互溶和傳質(zhì),體系的最佳溫度取決于兩者的平衡。本實(shí)驗(yàn)中豆粕的最佳反應(yīng)溫度為15 ℃,豆粕中的LOX具有更好的溫度耐受性,而且較高的溫度可以降低體系黏度,有利于傳質(zhì)。體系pH值會(huì)影響酶的解離狀態(tài)和構(gòu)象。pH可以改變酶蛋白的微環(huán)境,導(dǎo)致其催化行為也有所調(diào)整。考察pH對(duì)體系產(chǎn)率的影響,結(jié)果顯示pH值為9時(shí),LA-HPOD產(chǎn)率最高,與LOX酶的最佳pH值一致。

圖2 pH和溫度對(duì)LA-HPOD收率的影響Fig.2 Effects of pH and temperature on yield of LA-HPOD

2.3 豆粕和底物用量的影響

如圖3所示,顯示了催化劑豆粕和底物亞油酸用量對(duì)脂氧合酶反應(yīng)收率的影響。在15 ℃下,1.5 g亞油酸,0.5 mL乙醇,7.5 mL pH 9緩沖液體系中,對(duì)不同用量的豆粕(0.2～2 g)進(jìn)行研究,反應(yīng)時(shí)間為2.5 h。豆粕用量決定體系黏度和LOX活性大小。豆粕中的某些溶出物對(duì)亞油酸有一定乳化作用,加強(qiáng)了酶與底物的接觸,此外溶出物提高了體系的黏度,延長(zhǎng)了氧氣停留時(shí)間。過(guò)高的豆粕用量不利于反應(yīng)進(jìn)行。豆粕用量為1.5 g時(shí)LA-HPOD產(chǎn)量最高可達(dá)68%。在上述體系中,設(shè)定豆粕用量為1.5 g,考察不同底物用量下的收率,當(dāng)亞油酸的用量在1～1.5 g時(shí),獲得了滿意的產(chǎn)率。為提高效能,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用底物用量為1.5 g。

圖3 豆粕和亞油酸用量對(duì)LA-HPOD收率的影響Fig.3 Effects of soymeal and substrate dosage on yield of LA-HPOD

2.4 乙醇和緩沖液體積的影響

圖4顯示了在15 ℃,pH 9條件下,1.5 g豆粕和1.5 g亞油酸體系中,乙醇和緩沖液體積對(duì)LA-HPOD收率的影響。乙醇一定程度上可以提高底物的溶解度,增大LOX酶與底物的接觸機(jī)率。由于酶在與反應(yīng)環(huán)境的不同組分相互作用時(shí),構(gòu)象發(fā)生了變化,導(dǎo)致活性也有所調(diào)整[3]。乙醇體積在0～0.05 mL內(nèi),LA-HPOD產(chǎn)率隨乙醇體積比的增大而逐漸增大。繼續(xù)加大乙醇用量,反應(yīng)收率不再提高。過(guò)大量的乙醇會(huì)降低LOX的活性,導(dǎo)致LA-HPOD提取困難。綜上合適的乙醇用量為0.5 mL。最佳緩沖液體積比為0.75,LA-HPOD產(chǎn)率達(dá)68%。

圖4 乙醇和緩沖液體積對(duì)LA-HPOD收率的影響Fig.4 Effects of ethanol and buffer volume on yield of LA-HPOD

2.5 豆粕加入策略

之前有報(bào)道LOX酶的自催化失活,即氧化過(guò)程中LOX出現(xiàn)活性降低現(xiàn)象,需要補(bǔ)充新鮮酶來(lái)恢復(fù)活性。本節(jié)考察若在反應(yīng)后期補(bǔ)足更高的LOX酶活力,是否會(huì)提高氫過(guò)氧化物的產(chǎn)率。如何補(bǔ)充需要結(jié)合考慮LOX酶促反應(yīng)進(jìn)程中對(duì)LOX活力的實(shí)際需求。考慮到豆粕的黏度較高,釋放的LOX酶又是熱不穩(wěn)定的,因此設(shè)計(jì)了梯度加入豆粕的策略,以使豆粕得以最佳利用。15 ℃下,3 g亞油酸,1 mL乙醇,15 mL pH 9的緩沖液體系中,結(jié)果如圖5所示。未添加新鮮豆粕時(shí),LOX活性在1 h后開(kāi)始下降。策略C的反應(yīng)收率最低,其余4個(gè)策略差別不大,以策略D的LA-HPOD收率最高,達(dá)70%。根據(jù)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程,豆粕用量和LOX活性在反應(yīng)初始1 h對(duì)反應(yīng)影響最大。溶解出的蛋白質(zhì)和磷脂等能使體系較快的乳化,加快了反應(yīng)進(jìn)程。亞油酸在緩沖相中的不溶性阻礙了脂氧酶過(guò)氧化反應(yīng)的進(jìn)行,而豆粕的存在提供了更多的LOX活性,并形成了對(duì)LOX活性有利的微異質(zhì)界面。

A-1.5 g(0 h)+1.5 g(1 h),即初始添加1.5 g豆粕,1 h后再添加 1.5 g豆粕；B-2 g(0 h)+0.5 g(1 h)+0.5 g(2 h)；C-0.5 g(0 h)+ 0.5 g(1 h)+2 g(2 h)；D-2 g(0 h)+1 g(2 h)；E-3 g(0 h)圖5 豆粕加入策略Fig.5 Addition strategy of soymeal

2.6 超聲波強(qiáng)化傳質(zhì)

在上述優(yōu)化的最佳條件(1.5 g豆粕、1.5 g亞油酸、0.5 mL乙醇、7.5 mL pH 9硼酸緩沖液、15 ℃)的基礎(chǔ)上,將超聲波輻射引入到LOX脂氧化過(guò)程中,以期在2個(gè)不相容相之間提供足夠的接觸。如預(yù)期的那樣,超聲波將最終產(chǎn)率從70%提高到89%,平衡時(shí)間從2.5 h縮短至40 min(圖6)。表明超聲波作用明顯加快了LOX酶催化亞油酸體系的反應(yīng)進(jìn)程,同時(shí)提高了反應(yīng)產(chǎn)率。超聲波輻射可增加亞油酸與LOX活性中心的接觸幾率,加快產(chǎn)物與酶的解離和活性中心的再生。其空化作用產(chǎn)生的局部微環(huán)境很可能影響了反應(yīng)平衡,促使過(guò)氧化反應(yīng)進(jìn)行得更徹底。因此豆粕與超聲波聯(lián)用是制備LA-HPOD的一種很有前途的技術(shù)。

圖6 超聲波輻射對(duì)LA-HPOD收率的影響Fig.6 Effects of ultrasonic radiation on yield of LA-HPOD

3 結(jié)論

LOX酶促反應(yīng)的產(chǎn)物氫過(guò)氧化脂肪酸是重要的藥物合成和香料生產(chǎn)的中間產(chǎn)物,具有較大的商業(yè)價(jià)值。但由于LOX熱穩(wěn)定性差,反應(yīng)時(shí)底物濃度很低,極大地限制了LOX的工業(yè)化應(yīng)用。為解決上述問(wèn)題,本文利用富含LOX的新鮮豆粕耦合綠色的超聲波技術(shù),試圖開(kāi)發(fā)一條工藝簡(jiǎn)單、底物濃度高、收率高、可規(guī)模化制備HPOD的方法,以實(shí)現(xiàn)良好的反應(yīng)效率和產(chǎn)率。本實(shí)驗(yàn)的最佳條件為：40 kHz,100 W超聲波輻射下,15 ℃,1.5 g豆粕和1.5 g亞油酸,0.5 mL乙醇,7.5 mL pH 9硼酸鹽緩沖液體系,超聲技術(shù)將產(chǎn)率從70%提高到89%,平衡時(shí)間從2.5 h縮短至40 min(以傳統(tǒng)攪拌體系做參照)。超聲輔助豆粕反應(yīng)體系提供了一種高底物濃度下綠色、快速、高效的合成氫過(guò)氧化脂肪酸的方法,大大降低成本和能耗,更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。