基于CaCO3模板制備大豆蛋白微球及槲皮素的體外釋放研究

董亞博,蘭天,趙俊娜,江連洲,隋曉楠,張妍,2*

1(東北農業大學 食品學院,黑龍江 哈爾濱,150030) 2(東北農業大學 園藝園林學院,黑龍江 哈爾濱,150030)

在體內條件下,微粒形態可以保護生物分子不被降解,并且有選擇性地達到控制釋放,同時也降低了免疫反應的風險[1]。近幾十年來,微粒被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等行業[2]。蛋白質和多肽作為重要的殼材料,在臨床中得到廣泛應用[3]。大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)具有良好的理化性質和功能性質[4]。作為微粒的單一或復合殼材料,SPI已被廣泛使用。自組裝[5]、乳化[6]以及噴霧干燥[7]等是目前常用的制備微粒的方法,但是這些方法一般難以控制粒徑,且難以保持蛋白的品質。目前,一種以CaCO3為模板制備微球的方式十分流行。

CaCO3由于制備過程簡單和溫和的分解條件,常用于多層膠囊的制造。制備的CaCO3顆粒是粒徑均一、多孔的球體[8]。利用靜電吸附作用也可以實現多種蛋白質微球的制備。如利用CaCO3制備花青素微球,改善花青素的遞送和消化規律[9]。通過CaCO3的模板作用改進阿霉素-殼聚糖微球,改善阿霉素在體內的消化特性等[10]。

槲皮素是對人體十分有益的物質。然而,槲皮素的水溶性低,生物利用度差,以及在生理介質中的不穩定性,限制了槲皮素作為健康促進劑的應用。本研究首次將SPI應用到CaCO3模板上,制備大豆蛋白微球,通過包埋率的計算、掃描電鏡、冷凍電鏡等方法,對SPI包埋特性以及蛋白微球性能進行分析。并以槲皮素為例,制備槲皮素-蛋白質復合微球,探究其對槲皮素模擬體外釋放特性的影響,以期該大豆蛋白微球為營養物質、藥物等在體內遞送提供新型的運輸載體。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆,黑龍江省農業科學院；無水氯化鈣、無水碳酸鈉,恒興化學試劑制造有限公司；實驗中所用試劑均為分析純。

UV-2600紫外分光光度計,上海美譜達儀器有限公司；Microfuge 20R冷凍離心機,美國貝克曼公司；S-3400 N SEM場發射掃描電子顯微鏡,日本日立公司；Mastersizer 2000激光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司；rf-6000熒光譜儀,日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備

參考鞠夢楠等[11]的方法,將脫脂豆粉分散在蒸餾水中,用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.0,并離心,收集上清液并用2 mol/L HCl溶液將pH值調節至4.5,離心收集沉淀物并用2 mol/L NaOH溶液調至中性,然后水洗除去雜質,將此蛋白溶液冷凍干燥后得到SPI,經研磨后放入干燥器備用。

1.2.2 SPI-CaCO3復合微球的制備

參考VOLODKIN等[12]的方法稍作修改,將10 mL 0.33 mol/L的Na2CO3溶液分別加入到含有不同質量濃度SPI(0、1、3、5 mg/mL)的10 mL 0.33 mol/L的CaCl2溶液中。混合溶液用磁力攪拌器在1 000 r/min下攪拌30 min。然后將所得懸浮液過濾,將濾紙上剩余殘渣用蒸餾水沖洗3遍。沉淀放入烘箱烘干并稱質量,收集所有的濾液及漂洗水。利用紫外分光光度計在280 nm處測定懸浮液濾液和漂洗水的吸光值,以此計算濾液中蛋白的含量。包埋率計算如公式(1)所示：

(1)

未包埋的蛋白含量為測得的濾液和漂洗水中的蛋白含量總和。利用包埋率計算CaCO3上包埋蛋白質的質量,總沉淀物的質量減去這部分蛋白質的質量,將剩余其他沉淀物的質量除以Na2CO3與CaCl2質量之和,計算得出CaCO3的產率。蛋白質的荷載比計算如公式(2)所示：

(2)

1.2.3 大豆蛋白微球的制備

參考MADADLOU等[13]的方法稍作修改,將CaCO3沉淀按其原pH進行復溶,并向SPI-CaCO3復合微球懸浮液(10 mg/mL)中加入谷氨酰胺轉氨酶(0.1 unit/mg SPI),磁力攪拌2 h(37 ℃,200 r/min)。攪拌結束后,將CaCO3顆粒懸浮液冷卻至室溫,并把配制好的0.25 mol/L 的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)與SPI-CaCO3復合微球懸浮液按照體積比1∶1加入到懸浮液中。隨后將懸浮液磁力攪拌24 h(4 ℃,100 r/min),以此來螯合CaCO3模板。所得樣品在蒸餾水中透析3 d,除去EDTA和Ca2+,在透析袋中加入疊氮化鈉(質量分數0.005%)來抑制微生物的生長。

1.2.4 粒徑表征

參考VOLODKIN等[14]的方法稍加修改,利用激光粒度儀對CaCO3、SPI-CaCO3復合微球和大豆蛋白微球樣品進行粒徑分布測定,以此來表征整個實驗過程中CaCO3以及大豆蛋白的粒徑變化。

1.2.5 冷凍掃描電鏡

參考YU等[15]的方法稍加修改,將SPI-CaCO3復合微球和大豆蛋白微球分別放置在鋁鉑上,在液氮(-210 ℃)中進行冷凍,隨后將冷凍后的樣品轉移到低溫系統中,最終在放大倍數50 000×下獲得冷凍掃描圖像。

1.2.6 熱穩定性分析

根據MIRIANI等[16]的方法稍作修改,將SPI與制備好的大豆蛋白微球用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋到0.1 mg/mL,在80 ℃下加熱20 min。使用280 nm的激發光譜以及300～450 nm的發射光譜對加熱后的樣品進行熒光檢測。

1.2.7 槲皮素-蛋白質復合微球的制備

將0.1 g槲皮素與10 mL 0.33 mol/L的Na2CO3進行混合,利用磁力攪拌器在300 r/min下攪拌15 min,隨后將10 mL 0.33 mol/L CaCl2加入混合溶液,后續實驗操作與大豆蛋白微球制備方法一致,制備完成即為蛋白質槲皮素復合微球。

1.2.8 槲皮素-蛋白質復合微球的定量及體外釋放

將20 mg槲皮素-蛋白質復合微球溶于20 mL PBS中,加入2 μL水解蛋白酶,在50 ℃下水解3 h,用紫外分光光度計在374 nm波長下測定水解液吸光值,從而確定復合微球中槲皮素含量。參考MINEKUS等[17]的方法,配制胃、腸模擬液,取20 mg樣品溶液于20 mL電解液中,胃部的模擬pH值為3,加入25 000 U/mg的胃蛋白酶,隨后將混合液置于透析袋中,每15 min取1次透析液,利用紫外分光光度計在374 nm下測定吸光值。將樣品在胃部的模擬環境中釋放1 h,隨后加入15 000 U/mg的胰蛋白酶以及5 mg/mL的膽鹽,將pH值調節至7,后續與胃部模擬一致。釋放過程中取透析液在374 nm處測定吸光值。

1.3 統計分析

所有的測量均在3次以上,結果均以平均值±標準差表示。均數比較采用單因素方差分析(ANOVA) 和鄧肯檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 包埋特性的分析

由圖1可知,加入SPI后CaCO3的生成率沒有明顯變化。但包埋率隨著SPI濃度的增加有所下降,而裝載率隨著蛋白濃度的增加而相應的增加。在MADADLOU等[13]的實驗中發現了相似的變化規律。這可能與SPI吸附到CaCO3微球表面的方式有關。一般來說,由于CaCO3多孔的結構會為SPI的吸附提供一定的毛細力,CaCO3與蛋白質攜帶的不同電荷也為吸附作用提供了靜電相互作用。當包埋到CaCO3表面的SPI到達一定量后,毛細力和靜電相對減弱,因此SPI不會無休止的吸附到CaCO3上。近年來,BABABUSHEVICH等[18]研究了抑肽酶、胰島素和過氧化氫酶包埋到CaCO3上的包埋規律,發現相較于蛋白質的分子質量,蛋白質的等電點更能主導裝載量的變化。因此可以推斷靜電相互作用是蛋白質包埋的主要作用力。

圖1 SPI添加量對CaCO3的包埋特性的影響Fig.1 The yield of CaCO3 microparticles,coating efficiency and loading ratio in different SPI concentration

2.2 粒徑分析

由圖2可知,CaCO3的粒徑比較均一,主要分布在3～12 μm,這與VOLODKIN等[12]的研究結果一致。CaCO3因其具有非常小的粒徑分布范圍,在一些抗癌藥物的遞送中有著優異的表現[19]。如圖2所示,在CaCO3模板上包埋SPI后,SPI-CaCO3復合微球的粒徑會增大。D50指樣品的累計粒度分布百分數達到50%時所對應的粒徑。樣品A～D的D50分別是9.150， 10.258, 11.701和8.669μm。結合圖3掃描電鏡圖片,在加入SPI后,生成的SPI-CaCO3復合微球是非常圓滑的球面,而未加蛋白的CaCO3微球表面附著了一些不規則的CaCO3附著物,由此推斷這可能是在加入SPI后復合微球粒徑減小的主要原因,在MADADLOU等[13]的研究中也解釋了類似的現象,在加入蛋白后促進了離子更好的融合,減少了不規則的物質,從而形成了更小的微粒。當使用EDTA螯合CaCO3后,蛋白微球的粒徑增大,這可能是因為模板的去除使SPI不能繼續維持完整球形結構,具有“坍塌”的現象,因此粒徑會增大。

A-CaCO3微球；B-1 mg/mL SPI-CaCO3復合微球；C-3 mg/mL SPI-CaCO3復合微球；D-5 mg/mL SPI-CaCO3復合微球； E-1 mg/mL SPI微球；F-3 mg/mL SPI微球；G-5 mg/mL SPI微球圖2 粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution

2.3 掃描電鏡分析

由圖3-a可知,未添加SPI的CaCO3表面多孔,賦予了它非常高的表面積。由圖3-b可知,添加SPI后,CaCO3的表面十分光滑,且更加均一,分散程度更好,這可能是由于SPI的加入限制了CaCO3的成長,減少了表面附著的不規則的CaCO3[20]。由圖3-c可知,當SPI失去CaCO3模板的支撐后會形成塌陷的結構,不會繼續維持完整的球形。這些結構的變化也與粒徑的變化規律相符,表面附著物的減少,使得粒徑有所降低,蛋白質結構的坍塌變形,造成粒徑變大。在VOLODKIN等[21]的實驗中,有著類似的實驗現象,蛋白質的脫水以及脫去模板后蛋白質機械強度降低是造成蛋白質坍塌的主要原因[22]。但是即便如此,蛋白微球依舊維持著多孔的結構,這為蛋白微球作為遞送載體承載藥物或營養物質提供了可能,類似球形的結構也使蛋白微球擁有制備高蛋白飲料的機會。

a-CaCO3；b-3 mg/mL SPI-CaCO3復合微球；c-3 mg/mL SPI微球圖3 CaCO3、3 mg/mL SPI-CaCO3復合微球和3 mg/mL SPI微球的掃描電鏡圖Fig.3 The scanning electron microscopy (SEM) images of CaCO3,3 mg/mL CaCO3-SPI microparticles,and 3 mg/mL SPI microparticles

2.4 蛋白微球的熱穩定性分析

由圖4可知,相較于SPI,將SPI制備成蛋白微球后,熒光強度有所增加。一般情況下,堿性環境使蛋白質變性,從而在355 nm附近有吸收峰,但本實驗中蛋白質在355 nm處沒有出現吸收峰,這代表堿性條件沒有使蛋白質變性[23]。隨著蛋白質濃度的增加,熒光強度有所降低,熒光的強度與蛋白質內疏水性色氨酸殘基的暴露程度密切相關,同時二硫鍵會淬滅色氨酸熒光,酰基的轉移也會使熒光降低[24]。熒光強度的降低可能是由于蛋白質濃度增加時,蛋白質被谷氨酰胺轉氨酶催化生成了更多的二硫鍵以及酰基的轉移所致。此外,經過加熱的蛋白微球僅發生了較小范圍的紅移(由333 nm紅移到337 nm),然而未經加工的SPI則發生了較大的紅移(由328nm紅移到344 nm)。熱處理會通過破壞氫鍵和非極性疏水基團來影響蛋白質的三維結構,這些結構的破壞使得熒光峰值發生偏移。因此,蛋白微球的制備增強了蛋白質的熱穩定性。

圖4 不同濃度下制備的蛋白微球和加熱后的 蛋白微球熒光圖譜Fig.4 Fluorescence spectra of unheated and heated SPI,SPI microparticles of different concentration

2.5 槲皮素-蛋白質復合微球體外釋放

槲皮素在人體內的吸收主要在小腸,所以槲皮素的延緩釋放非常重要,通過對槲皮素蛋白質復合微球的體外釋放行為的研究能夠很好地評價復合微球的緩釋行為。如圖5所示,槲皮素-蛋白質復合微球在模擬胃部釋放的過程中呈現出勻速的釋放方式,2 h內釋放量達到槲皮素總量的32.419%,在腸道內的釋放,前期釋放較慢,在45～90 min內釋放速度較快,達到槲皮素總量的35.580%,后續在釋放時間為4 h時達到槲皮素總量的71.205%,證實了蛋白微球對槲皮素的釋放有一定的延緩釋放的作用。復合微球在模擬胃液和模擬腸液中都沒有達到100%的釋放量,這可能是由于復合微球制備過程中碳酸鈣的脫去不完全,導致復合微球中碳酸鈣對蛋白質及槲皮素有一定的吸附作用,從而影響了槲皮素的釋放速率。

a-pH 3；b-pH 5圖5 槲皮素-蛋白復合微球的體外模擬釋放特性Fig.5 In vitro release profiles of quercetin-CaCO3 composite microsphere

3 結論與討論

在本研究中,利用多孔、高表面積、粒徑均一的碳酸鈣作為模板,首次將大豆分離蛋白包埋到碳酸鈣模板上,通過調節不同的蛋白加入量,螯合掉碳酸鈣模板,制備出粒徑均一的蛋白微球,主要為需要在體內特定部位釋放的物質提供一種新型的更天然、更具營養價值的運輸載體,并對其結構和功能進行了探究。通過電子顯微鏡,激光共聚焦和冷凍電鏡結果可知,蛋白質的加入會改善碳酸鈣不規則的樣貌,蛋白質會進入到碳酸鈣的表面以及孔隙中,且制備的蛋白微球維持多孔結構,具有作為微膠囊遞送藥物或營養物質的潛力。最后通過對熱處理后的蛋白微球進行熒光分析可知,本實驗制備的蛋白微球具有較好的熱穩定性,能夠承受巴氏殺菌等需加熱的加工過程。槲皮素作為示例物質,其在微球中釋放特性表明,復合微球對槲皮素具有一定的緩釋作用,這一結果有效解決了槲皮素生物利用度差的問題,因此大豆蛋白微球作為一種遞送載體具有一定的可行性。