市售不老莓果汁類產品酚類物質與有機酸解析及抗氧化能力比較

李海波,郜毓堃,魏麗萍,楊亞平,鮑詩晗,蘭天,孫翔宇,馬婷婷*

1(山西潞安石圪節智華生物科技有限公司,山西 長治,046299) 2(西北農林科技大學 食品科學與工程學院,陜西 楊凌,712100) 3(西北農林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌,712100)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa(Michx.)Ell.),原產于美國東北部,是一種集食用、藥用、園林和生態等價值于一身的珍貴經濟樹種[1],其漿果(俗稱野櫻莓、不老莓)富含黃酮、花青素和多酚等物質。20世紀90年代,不老莓被引種至中國,并于遼西地域開始栽培[2],截至2015年,該樹種在我國栽培面積約為533～600 hm2,遼寧、吉林、黑龍江、內蒙古、河南、河北、北京、山東、新疆、江蘇、山西等13個省(自治區、直轄市)均有不同面積種植。近年來,我國相繼完成了繁殖、栽培、區域試驗等方面的研究[3]。2018年9月,不老莓通過我國國家衛生健康委員會審查,成為新食品原料[4],正式在食品加工領域嶄露頭角。

不老莓提取物具有極強的抗氧化、抗炎、抑菌等生物活性,在治療和預防癌癥、心血管疾病、慢性炎癥、輻射病、重金屬中毒癥等多種疾病中起到一定作用[5-8]。同時,不老莓富含多酚類物質,如花青素、黃酮等的含量高于大部分已知植物[9],是天然的抗氧化劑資源,也是決定不老莓生物活性的關鍵因素。此外,研究表明不老莓中含有豐富的有機酸類物質,也為其生物活性作出貢獻。另一方面,由于其縮合單寧含量較高,使果實口感較澀,不適宜鮮食。但是,不老莓漿果出汁率可高達(78.65±1.05)%[10],因此,通過工藝手段將不老莓加工成果汁,可以豐富其口感,降低澀感,同時較大程度地保留其生物活性。總體而言,不老莓果汁類產品具有非常廣闊的市場前景。目前,不老莓果實中多酚與有機酸組成已有一定研究,但仍缺乏對不老莓果汁類產品酚類物質與有機酸特征的相關研究,對于消費者的選購與不老莓果汁的產業化發展均造成了一定的影響。

綜上,本研究通過對市售不老莓果汁類產品的有機酸與酚類物質組成進行解析,同時分析與抗氧化能力的相關性,從而對此類產品的營養價值與抗氧化能力作出評價,以期為消費者的選購與不老莓果汁的產業化發展提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種市售不老莓果汁類產品購于超市或網上商城,樣品信息如表1所示。

表1 六種市售不老莓果汁類產品Table 1 Six kinds of commercial A.melanocarpa juices

福林酚(濃度1 mol/L),北京索萊寶科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine,TPTZ)(純度≥98%)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)(濃度≥98%),上海源葉科技有限公司；DPPH試劑(純度>97.0%),梯希愛化成工業發展有限公司；沒食子酸、原花青素B1、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素、原花青素B2、龍膽酸、咖啡酸、反式對香豆酸、反式阿魏酸、槲皮素-3-D-β-葡萄皮糖苷、槲皮素、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸(濃度≥98%),美國Sigma公司；甲醇、乙腈(均為色譜純),美國Tedia公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5804R冷凍離心機,德國Eppendorf公司；UV2800紫外分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀,包括自動進樣器、柱溫箱、Waters 2996 紫外檢測器、Empower 色譜工作站,美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

10 mL果汁經8 000 r/min離心10 min,取上清液稀釋,得到待測樣品。

1.3.2 總酚含量測定

參照LI等[11]采用福林酚法并稍作改動。取待測樣品0.2 mL于10 mL比色管,先后加入2 mL 稀釋10倍的福林酚溶液和1.8 mL質量分數7.5%的Na2CO3溶液,混勻避光放置1 h,于765 nm處測定吸光度值,結果以沒食子酸當量表示。沒食子酸標準溶液的質量濃度為0～200 mg/L,標準曲線為y=0.005 7x+0.056 6(R2=0.999 0)。

1.3.3 總黃酮含量測定

參照PRAKASH等[12]的方法并稍作改動。取5 mL待測樣品于10 mL比色管中,加入質量分數5% NaNO2溶液0.3 mL,避光反應6 min,加入質量分數10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,避光反應6 min,再加入1.0 mol/L NaOH溶液2 mL,并使用體積分數30%乙醇定容至10 mL,避光反應15 min,于510 nm處測吸光度值,結果以兒茶素當量表示。兒茶素標準溶液質量濃度為0～60 mg/L,標準曲線為y=0.016 2x+0.016 3 (R2=0.999 2)。

1.3.4 總花色苷含量測定

參照劉樹勛等[13]的方法并稍作改動。取一定體積未稀釋原果汁于2支10 mL比色管中,分別使用pH 1.0 HCl-KCl緩沖液和pH 4.5 HCl-CH3CO2Na·3H2O溶液定容至5 mL,于黑暗處反應15 min,測定反應液在520及700 nm處的吸光度值,pH 1.0反應液體系在520及700 nm處吸光度相減記為A1,pH 4.5反應液體系在520及700 nm處吸光值相減記為A2,樣品花色苷含量按公式(1)計算:

(1)

式中：MW,二甲花翠素葡萄糖苷分子質量493.5；DF,稀釋倍數；ε,二甲花翠素葡萄糖苷的消光系數28 000。

1.3.5 縮合單寧含量測定

參照王儲炎等[14]的方法并稍作改動。取待測樣品0.5 mL于10 mL比色管中,先后加入3%的香草醛-甲醇溶液2.5 mL及體積分數30%的硫酸-甲醇溶液2.5 mL,30 ℃避光反應20 min后于500 nm處測定吸光度值,結果以兒茶素當量表示。兒茶素標準溶液質量濃度為0～400 mg/L,標準曲線為y=0.002 4x+0.008 8 (R2=0.999 5)。

1.3.6 HPLC測定單體酚及有機酸含量

(1) 樣品處理

取10 mL果汁8 000 r/min離心10 min,上清液使用純凈水稀釋,0.45 μm濾膜過濾后待測。

(2)單體酚含量測定

色譜柱：CAPCELL PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫28 ℃；DAD檢測器,檢測波長280 nm；進樣量10 μL,以峰面積外標法定量。

梯度洗脫：流速0.5 mL/min；流動相A：V(水)∶V(乙腈)=19∶1,含體積分數0.3%乙酸；流動相B：V(乙腈)∶V(水)=9∶1,含體積分數0.2%乙酸。

梯度洗脫程序：0～16 min,B為12%～14%；16～18 min,B為14%；18～30 min,B為14%～16%；30～36 min,B為16%～20%；36～46 min,B為20%～24%；46～56 min,B為24%～30%；56～66 min,B為30%～50%；66～70 min,B為50%；70～80 min,B為50%～12%；80～85 min,B為12%。

(3)有機酸含量測定

色譜柱：CAPCELL PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫45 ℃；DAD檢測器,檢測波長210 nm；進樣量10 μL,以峰面積外標法定量。

等度洗脫：流速0.5 mL/min；流動相A：0.02 mol/L K2HPO4,H3PO4溶液調節pH至2.3；流動相B：甲醇。

洗脫程序,流動相A∶B=99∶1(體積比)。

1.3.7 抗氧化活性測定

(1)鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)

參照BENZIE等[15]的方法并稍作改動。取0.25 mL待測樣品和8 mL TPTZ工作液于10 mL比色管中,37 ℃反應15 min,在593 nm處測定其吸光度值,FRAP以Trolox當量表示。Trolox標準溶液濃度為0～1 mmol/L,標準曲線為y=1.154 4x+0.270 9 (R2=0.999 7)。

(2)DPPH自由基清除能力

參照文獻[16]的方法并稍作改動。取0.25 mL待測樣品和4 mL DPPH反應液于10 mL比色管中,避光反應30 min,在517 nm處測定其吸光度值,DPPH自由基清除能力以Trolox當量表示。Trolox標準溶液濃度為0～1 mmol/L,標準曲線為y=-1.228 5x+1.737 (R2=0.999 5)。

1.3.8 數據分析

所有實驗重復3次,結果以(x±s)表示。采用SPSS 21.0軟件單因素ANOVA模塊對數據進行單因素方差分析,雙變量相關模塊計算Pearson系數對數據進行相關性分析,以P≤0.05表示差異顯著,以P≤0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 市售不老莓果汁類產品酚類物質含量分析

不老莓果汁類產品的酚類化合物種類與其果實一致,包括單體多酚及聚合多酚2種。單體多酚由酚酸、黃酮和花青素及其糖苷類化合物組成,其中花色苷是主要的呈色物質。聚合多酚即縮合單寧,由不同數量的表兒茶素微粒和兒茶素聚合而成,為呈澀物質[17]。

研究表明,不老莓果實中花色苷約占總酚含量25%,且遠高于黃酮類化合物含量[18],這與不老莓果汁類產品的測定結果有較大差異。如圖1所示,在不老莓果汁類產品中,黃酮類化合物占總酚含量21%～63%,而花色苷最多僅占總酚含量6%,最低為K-30%,未檢出花色苷類物質。花色苷保留率與溫度顯著相關,WILKES等[19]研究了不老莓果汁加工過程中及其在25 ℃、6個月貯存期內花青素的穩定性,發現熱處理后花青素被大量降解,其濃度呈線性下降。而較低溫度和較低pH值貯藏的不老莓中花青素的含量最高,這在HOWARD等[20]的實驗中得到了證實。實驗結果表明,深加工果汁會造成不老莓果實中花青素及其糖苷類化合物的較大損失。

不老莓果實中,呈澀物質縮合單寧的總酚含量占比高達66%[18],由圖1可知,在其果汁類產品中,縮合單寧占總酚含量5%～31%,與果實相比顯著降低,從而使澀感降低,風味得到較大改善。然而,縮合單寧具有極強的抗氧化能力,是不老莓生物活性的最重要來源之一。因此,在果汁加工過程中,若一味追求除去縮合單寧以降低澀感,則會導致產品營養價值大大下降。ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%產品中,縮合單寧均占總酚含量約30%左右,較好地實現了果汁產品口感與營養價值的平衡。

2.2 市售不老莓果汁類產品單體酚組成差異分析

在所有樣品中,共檢測出12種單體酚(表2),其中包括7種酚酸(沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、龍膽酸、咖啡酸、反式對香豆酸、反式阿魏酸),3種黃烷醇(原花青素B1、原花青素B2、兒茶素)及2種黃酮醇(槲皮素-3-D-β-葡萄糖苷、槲皮素)。L-45%是唯一檢測出咖啡酸、反式對香豆酸及槲皮素-3-D-β-葡萄糖苷的樣品；而槲皮素只在ZH-30%、ZH-40%、ZH-100%中存在；K-30%單體酚種類及含量均最低。

表2 市售不老莓果汁類產品單體酚含量及組成差異Table 2 Content and composition differences of mono-phenols in commercial A.melanocarpa juices

酚酸是不老莓果實及其加工產品中最主要的單體酚類化合物,綠原酸與新綠原酸被認為是不老莓中主要的非類黃酮多酚類化合物[21-22]。ROP等[23]通過對5個不老莓品種Aron、Fert?di、Hugin、Nero和Viking的實驗證實了綠原酸和新綠原酸是非常重要的抗氧化劑,果實抗氧化能力與二者均呈線性正相關關系,相關函數分別為y=0.007 5x-0.105 2 (R2=0.788)及y=0.025 8x-1.326 8 (R2=0.940)。在6種被測樣品中,ZH-100%綠原酸含量最高,因此其抗氧化能力較強。

3種黃烷醇類化合物在6種被測樣品中廣泛存在,且含量均較高。原花青素B1、原花青素B2及兒茶素聚合度均小于6,屬于低聚原花青素,是不老莓果實及其相關產品中有效的生物活性成分。此外,原花青素聚合程度與其生物利用率關系顯著,低聚合度更有利于人體腸道對原花青素的吸收[24]。ZH-100%兒茶素及原花青素B2含量顯著高于其他樣品,是人體原花青素的優質來源。

a-總酚；b-總黃酮；c-總花色苷；d-縮合單寧圖1 市售不老莓果汁類產品酚類物質含量Fig.1 Phenolic content of commercial A.melanocarpa juices 注：組間不同小寫字母代表差異顯著(P≤0.05)(下同)

2.3 市售不老莓果汁類產品有機酸組成差異分析

已有研究表明,不老莓屬于蘋果酸型果實,有機酸類型以蘋果酸和檸檬酸為主,其鮮果中蘋果酸含量為1.31%,檸檬酸含量為0.21%[28]。此外,不老莓果實中也含有其他種類的有機酸,如奎寧酸、莽草酸等,為其抗氧化活性作出貢獻。與鮮果相比,市售不老莓果汁類產品中蘋果酸與檸檬酸含量顯著降低,這說明將不老莓加工成果汁產品,可以使其酸甜度更協調,改善風味,消費者接受度更高。具有抗氧化活性的奎寧酸與莽草酸同樣在果汁產品中被檢測到(表3)。

表3 市售不老莓果汁類產品有機酸含量及組成差異Table 3 Content and composition differences of organic acids in commercial A.melanocarpa juices

研究發現,檸檬汁與5%(體積分數)的不老莓果汁混合,得到的混合果汁花青素保留率更高,比單純的檸檬汁或不老莓果汁抗氧化能力更強[29]。ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%檸檬酸含量高于同系列100%果汁ZH-100%,表明前者在加工過程中額外添加了檸檬酸,這不僅可以改善果汁風味,還對花青素穩定性具有積極影響。

2.4 市售不老莓果汁類產品抗氧化活性分析

市售不老莓果汁類產品抗氧化能力測定結果如圖2所示。L-45%抗氧化能力最強,其次是ZH-100%、ZH-40%、ZH-30%和ZH-20%,K-30%抗氧化能力最弱。ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%在低濃度果汁產品中表現出較強的抗氧化能力。L-45%抗氧化活性最強,這是由于其屬于復配產品,調配過程中添加了其他水果的濃縮汁。抗氧化活性測定結果表現與酚類物質含量一致,即酚類物質含量越高,抗氧化能力越強。

圖2 市售不老莓果汁類產品抗氧化活性Fig.2 Antioxidant capacity of commercial A.melanocarpa juices

褚大可等[30]測定了14種不同類別市售果汁的抗氧化能力,其中葡萄果汁鐵離子還原能力最弱,為1 114.31 μmol Trolox/L；檸檬汁抗氧化能力最強,但也僅為3 262.97 μmol Trolox/L。而本實驗測定出ZH系列果汁及L-45%的鐵離子還原能力高達2.587～24.717 mmol Trolox/L。因此,市售不老莓果汁抗氧化活性遠高于其他類型果汁,具有極高的營養價值。

有研究發現,4 kPa真空度下浸漬有利于不老莓抗氧化成分的穩定[31]。這或許可以為不老莓果汁類產品加工工藝的改進提供新思路。

2.5 市售不老莓果汁類產品有機酸及酚類物質含量與抗氧化活性相關性分析

由圖3可知,FRAP及DPPH抗氧化活性與酚類物質含量均呈極顯著(P≤0.01)正相關關系,包括總酚、總黃酮、總花色苷、縮合單寧以及沒食子酸和奎寧酸2種酚酸。這說明在不老莓果汁類產品中,酚類物質是最主要的抗氧化活性來源,沒食子酸及奎寧酸是提供生物活性的重要酚酸類化合物。

圖3 市售不老莓果汁類產品酚類物質及有機酸含量與抗氧化活性相關熱圖Fig.3 Heat map of phenolic compounds and organic acids content and antioxidant activity of commercial A.melanocarpa juices 注：*代表相關性顯著,P≤0.05；**代表相關性極顯著,P≤0.01

原花青素B2、龍膽酸、咖啡酸、反式對香豆酸、槲皮素-3-D-β-葡萄糖苷及有機酸中的乳酸和乙酸與FRAP、DPPH呈顯著(P≤0.05)正相關關系,也為不老莓果汁類產品的營養價值作出貢獻。

值得一提的是,乙酸與總酚、總花色苷、縮合單寧均有極顯著(P≤0.01)正相關關系,Pearson系數分別為0.928、1.000和0.956。乳酸與總酚、總花色苷呈顯著正相關(P≤0.05),Pearson系數分別為0.908、0.913,與縮合單寧呈極顯著(P≤0.05)正相關,Pearson系數為0.940。這表明在不老莓果汁加工過程中,以乳酸與乙酸為代表的部分有機酸對酚類物質有一定的保護作用,可以減少其降解。因此,有機酸含量較高的ZH-100%是優良的低濃度不老莓果汁加工原料。

3 結論

本實驗研究了K-30%、ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%、ZH-100%及L-45%共6種市售不老莓果汁類產品的有機酸類物質、酚類物質含量及抗氧化活性,并進行了相關性分析。結果表明,與不老莓果實相比,深加工為果汁后,6種果汁普遍損失了較多花青素及其糖苷類化合物；ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%產品縮合單寧在總酚含量中占比合理,較好地實現了口感與營養價值的平衡。ZH-100%綠原酸及低聚原花青素(兒茶素、原花青素B2)含量顯著高于其他樣品,具有良好的抗氧化能力,也是人體原花青素的優質來源。總酚、總黃酮、總花色苷、縮合單寧以及沒食子酸和奎寧酸與抗氧化能力呈極顯著正相關關系,酚類物質是不老莓果汁類產品最主要的抗氧化活性來源,沒食子酸及奎寧酸是為其提供生物活性的重要酚酸類化合物。在不老莓果汁加工過程中,檸檬酸對花青素有一定的保護作用,因此,與其他低濃度不老莓果汁相比,額外添加檸檬酸的ZH-20%、ZH-30%、ZH-40%花青素穩定性更強、含量更高。有機酸含量較高的ZH-100%是優良的低濃度不老莓果汁加工原料,本研究通過對市售不老莓果汁類飲料的生物活性物質及抗氧化能力進行分析評價,為此類產品的開發提供了數據基礎,也為不老莓果汁加工工藝的完善提供了改進方向。