液相色譜內標法測定嬰幼兒配方食品中色氨酸含量

別梅,孫立臻,王駿,薛霞,劉艷明*

1(山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南,250101) 2(山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心,山東 濟南,250101)

色氨酸是人體的必需氨基酸之一,參與機體蛋白質的合成和代謝調節,它是煙酸、5-羥色胺、褪黑激素等生物活性物質的前體物,影響蛋白質、糖類和脂肪等營養物質的代謝。當人體缺乏色氨酸時會引起皮膚疾患、玻璃體退化及心肌纖維化等病癥[1]。相較于成人,嬰幼兒時期生長發育迅速,在該時期色氨酸及其代謝物對大腦的發育和對進食-飽足、睡眠-覺醒規律等神經行為的調節發展至關重要,因此必須保證嬰兒食品中相關營養素的含量和質量[2-4]。消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態的兒童對營養素或膳食有更為特殊的需求。

嬰幼兒配方乳粉和特殊醫學用途嬰兒配方食品作為特定人群的食物來源,其營養成分組成在國家標準中都有特殊規定,對色氨酸的含量和添加形式都有相關的要求[5-6],但缺乏相應的檢測方法標準。目前,測定色氨酸的檢測方法包括分光光度法[7]、電化學法[8]、氨基酸分析儀法[9]、高效液相色譜法[10-15]、液相色譜串聯質譜法[16]和離子色譜法[17]等,液相色譜方法的特異性和定量準確性均有優勢。色氨酸多以蛋白質的形式存在于樣品中,需水解為游離態后才能測定。目前通常采用的堿水解方法需長時間在高溫、高濃度堿液條件下進行,色氨酸有一定損失,且在不同的基質中色氨酸的損失程度不完全一致。

本研究在經典堿水解方法的基礎上引入結構與色氨酸相似的內標物α-甲基色氨酸,以內標法定量,使同一水解條件同時適用于嬰幼兒配方乳粉和特殊醫學配方嬰幼兒配方食品(乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方)中色氨酸含量的準確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色氨酸標準品(C11H12N2O2,CAS號：73-22-3,純度99.7%),德國Dr.Ehrenstorfer公司；α-甲基-色氨酸標準品(C12H14N2O2,CAS號：110 117-83-4,純度98%),上海甄準生物科技有限公司；甲醇(色譜純),美國Merck公司；醋酸銨(色譜純)、乙酸(色譜純),美國Fisher Chemical公司；LiOH(分析純)、鹽酸(分析純),國藥集團化學試劑有限公司；聚四氟乙烯材質水解管,帶螺紋口外蓋,內襯聚四氟乙烯密封墊；水相微孔濾膜(0.22 μm),上海安譜；NIST配方乳粉質控樣1849a[(184±10)mg/100 g,k=2]、NIST配方乳粉質控樣1869[(228±24)mg/100 g,k=2]、嬰幼兒配方乳粉和特殊醫學配方嬰幼兒食品(乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方),均為市售。實驗室用水符合 GB/T 6682 規定的一級水要求。

1.2 標準溶液配制

色氨酸標準溶液(100 μg/mL)：準確稱取10.0 mg色氨酸標準品用水溶解后定容至100 mL；內標工作液(1 mg/mL)：稱取10 mg α-甲基-色氨酸標準品用水溶解后定容至10 mL。

1.3 儀器與設備

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀配有熒光檢測器,美國Thermo Fisher公司；KQ-800DE超聲清洗儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；MS204TS電子天平,瑞士梅特勒公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱干燥箱,上海新苗醫療器械制造有限公司；MS 3 basic渦旋混合器,德國IKA公司；IQ 7000超純水儀,美國 Millipore 公司。

1.4 樣品前處理

準確稱取混合均勻的固體試樣200 mg(精確到1 mg)于配有密封墊的具塞螺紋口聚四氟乙烯離心管中,依次加入0.5 mL內標工作液、5 mL LiOH溶液(4 mol/L),渦旋混勻后于超聲波振蕩器中振蕩5 min,保證樣品完全溶解后,置于110 ℃烘箱中水解20 h。取出水解管,待冷卻至室溫后,用HCl溶液(4 mol/L)調pH值至3～8,將水解液全部轉移至50 mL容量瓶中并用水定容,混勻后經0.22 μm水相微孔濾膜過濾備用。

1.5 儀器條件

色譜柱：Xbridge C18(3.5 μm,150 mm×4.6 mm)；流動相A:乙酸銨溶液(10 mmol/L,pH 4.0);流動相B:甲醇;梯度洗脫,洗脫程序見表1；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL；熒光檢測器激發波長280 nm,發射波長346 nm。每次進樣前初始流動相比例平衡5 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結果與討論

2.1 儀器測定條件的選擇和優化

2.1.1 檢測器的選擇

色氨酸由于其特殊結構,既具有紫外吸收,又具有熒光響應。為使色氨酸的檢測能夠獲得較高的靈敏度,需要確定色氨酸的最大吸收波長,最佳激發波長與最佳發射波長。研究中首先通過二極管陣列檢測器(diode array detector,DAD)將色氨酸標準溶液在波長190～450 nm進行掃描,結果表明,在檢測波長280 nm處,色氨酸有明顯的特征吸收峰,且基質干擾較少,故將吸收波長280 nm作為紫外檢測器檢測色氨酸的檢測波長。同時將最大吸收波長280 nm作為激發波長通過熒光檢測器對色氨酸標準溶液進行發射光譜掃描,觀察到色氨酸在波長346 nm處具有較高的靈敏度。因此,實驗最終確定熒光檢測器激發波長為280 nm,發射波長為346 nm。

經大量樣本檢測表明,在相同流動相條件下,部分樣品的紫外色譜圖中在目標物的保留時間處有難以分離的干擾峰,并影響到定量結果的準確性,故采用熒光檢測器進行檢測和定量。樣品紫外檢測器譜圖和熒光檢測器譜圖見圖1。

圖1 樣品紫外檢測器與熒光檢測器譜圖比較Fig.1 Comparison of spectrogram between UV detector and fluorescence detector

2.1.2 流動相的選擇

流動相比較了體積分數0.1%的乙酸-甲醇溶液和10 mmol/L 醋酸銨溶液(pH 4.0)-甲醇體系的洗脫情況,結果表明在0.1%的乙酸溶液條件下個別樣品中有明顯的干擾峰,且難以與目標物有效分離,導致定量結果不夠準確。而在10 mmol/L 醋酸銨溶液(pH 4.0)條件下目標峰和內標峰均可以與干擾峰(圖2,峰3)達到基線分離。譜圖見圖2。

a-甲醇-0.1%乙酸溶液；b-甲醇-醋酸銨溶液圖2 梯度洗脫的色譜圖(pH 4.0)Fig.2 Chromatogram of gradient elution (pH 4.0)

2.2 試樣前處理條件的優化

2.2.1 堿的選擇

在樣品堿水解的過程中,考察不同的堿對水解結果的影響。本研究中,選擇蛋白質含量最高的乳粉基質作為實驗對象,選取了相同濃度(4 mol/L)的LiOH、NaOH和KOH 3種堿溶液在相同試驗條件下進行試驗,考察堿水解后色氨酸含量的變化,結果見圖3。結果表明,在相同的條件下,使用LiOH溶液處理的樣品中色氨酸含量最高,使用外標法定量回收率為83%,而NaOH溶液和KOH溶液對試樣中的色氨酸有不同程度地破壞,回收率只有76%和70%,故方法選定LiOH溶液作為水解過程中的堿溶液。

圖3 不同堿對色氨酸含量測定的影響Fig.3 Effect of different bases on the determination of tryptophan content

2.2.2 堿溶液濃度和水解時間的選擇

以NIST 1849a配方乳粉質控樣作為研究對象,使用2、3和4 mol/L 3種濃度的LiOH溶液分別水解18、20和22 h,測定的色氨酸含量如圖4所示。由圖4可知,2和3 mol/L堿溶液經22 h仍沒有水解完全,而4 mol/L的LiOH在18 h已經水解完全,繼續水解20和22 h沒有明顯變化,為了保證充分的水解,以準確測定總色氨酸的含量,選擇4 mol/L LiOH水解溶液、20 h作為最佳的水解條件

圖4 不同濃度堿溶液和不同水解時間對色氨酸水解的影響Fig.4 Effect of different concentration of alkali solutions and different hydrolysis time on tryptophan hydrolysis

2.2.3 水解溫度的確定

為考察水解溫度的影響,設計了100、110、120 ℃ 3個水解溫度進行考察,結果見圖5。110和120 ℃水解結果在18和20 h的時候無顯著差異,但120 ℃在22 h以后出現了明顯的下降；而在100 ℃條件下,樣品水解至22 h依然未能水解完全,且增加反應時間后,色氨酸濃度反而出現了下降,通過色氨酸標準品的堿水解實驗驗證,發現水解時間過長,游離色氨酸會部分被破壞,故本方法選擇110 ℃作為水解溫度。

圖5 不同溫度對色氨酸水解的影響Fig.5 Effect of different temperatures on tryptophan hydrolysis

2.2.4 堿水解法內標確定

由于堿水解過程溫度高,時間長,對不同的樣品進行加標回收試驗發現色氨酸長時間在高溫高濃度的堿中會有一定程度的損失,而且不同基質中色氨酸的損失不同。試驗增加了在堿水解過程中充氮保護的措施,結果表明,色氨酸的損失在充入氮氣保護后略有改善,但使用充氮保護下堿水解的方法測試質控樣NIST1849a,結果僅為168 mg/100 g,不能得到滿意的結果；參考標準GB/T 15400—2018 《飼料中色氨酸的測定》在水解前對樣品進行除脂,試驗結果表明除脂僅對水解液的外觀有所改變,對測定結果沒有改善。因此在優化前處理方法無法有效降低色氨酸損失的前提下,采用色氨酸的結構類似物作為內標進行同步校正,提高定量準確性的同時簡化樣品處理步驟。本方法將5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸作為研究對象來考察其作為內標物定量堿水解方法測定色氨酸含量的可行性。

先后選擇了NIST質控樣1849a和1869作為研究對象,分別加入5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸內標后進行堿水解。不同定量方式和不同內標的定量結果顯示(表2),相同條件下以α-甲基-色氨酸作為內標得到的2個質控樣的含量均能滿足明示的范圍,而5-甲基-色氨酸作為內標得到的結果偏高,外標法定量的結果則達不到質控樣的明示下限。以α-甲基-色氨酸作為內標來定量能得到更為準確的結果。

表2 不同定量方式和不同內標的定量結果Table 2 Quantitative results of different quantitative methods and internal standards

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍和定量限

準確吸取色氨酸標準溶液(100 μg/mL)20、100和500、1 000、2 000和5 000 μL于10 mL容量瓶中,加入100 μL內標(1 mg/mL)工作液,用水定容至刻度,混勻后得到質量濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標準工作溶液,分別將標準系列工作液按照濃度由低到高的順序注入液相色譜儀中,測得相應色譜峰的峰面積,以系列混合標準工作液的濃度為橫坐標,以目標化合物的峰面積與內標的峰面積的比值為縱坐標,繪制標準曲線。相關系數r>0.999,覆蓋方法定量限和常見樣品的含量水平,線性良好。將S/N>10且能準確定量的最低濃度點計算出的含量確定為方法的定量限。結果見表3。

表3 方法線性方程和定量限Table 3 Linear equation and limit of quantitation of the method

2.3.2 方法準確度和精密度

試驗選取代表性樣品進行加標回收試驗,樣品分別為嬰幼兒配方乳粉、乳蛋白部分水解樣品和氨基酸配方樣品,對樣品進行平行試驗得出本底值后再對每個樣品做0.5、1和2倍本底值水平的加標試驗,以回收率和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)評價方法的準確度和精密度。試驗樣品回收率和RSD見表4。樣品的平均回收率在92.5%～97.4%之間,RSD均<3.11%。將試驗樣品選取4家機構進行驗證,實驗室間RSD<6.7%,顯示了良好的準確度和精密度。

表4 不同樣品的回收率及精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of different samples

2.3.3 實際樣品應用

采用本研究建立的方法對21個不同種類樣品進行測定。樣品包括不同品牌嬰幼兒配方乳粉8個、乳蛋白部分水解配方食品4個、乳蛋白深度水解配方食品4個和氨基酸配方食品5個。樣品中色氨酸含量為170～315 mg/100 g,回收率92%～98%,均符合GB 10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》中對色氨酸含量的要求。

3 結論

本研究以α-甲基-色氨酸為內標物,采用堿水解-高效液相色譜法測定了乳粉及特殊醫學用途嬰兒配方食品中的色氨酸含量。內標法較好地校正了水解過程中高溫、高濃度堿溶液和不同基質在處理過程中對色氨酸的影響,同時省略了前處理過程中充氮氣保護等步驟,對該方法進行方法學驗證,也能得到滿意的準確度和精密度。應用于不同種類的樣品和質控樣中目標物的測定均符合明示值,表明該方法操作簡單、準確度高、重復性好,適用于乳粉及特殊醫學用途嬰兒配方食品中色氨酸的準確定性定量分析,可為企業生產和有關部門監管提供理論支撐。