成纖維細(xì)胞生長因子受體4基因沉默對口腔鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制*

董慶旭 趙鄭莉

（河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院口腔科，鄭州 451100）

口腔鱗癌約占所有口腔癌的90%[1]，多種基因突變的積累會導(dǎo)致口腔上皮細(xì)胞發(fā)展為癌癥[2]，患者5年生存率低于50%[3]。因此，研究口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常重要。研究證實(shí)，成纖維細(xì)胞生長因子受體4（fibroblast growth factor receptor 4，F(xiàn)GFR4）在胚胎發(fā)育、血管生成中起關(guān)鍵作用[4]。FGFR4 在腫瘤中的高表達(dá)[5]、多態(tài)性與肝癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。RAS/RAF/MAPK 通路能夠在細(xì)胞核中激活特定的基因促進(jìn)細(xì)胞生長和分化[7]，參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡[8]。RAS 是突變最頻繁的致癌基因，40%食管癌患者具有RAS 擴(kuò)增的特點(diǎn)[9]，大約50%的乳腺癌與RAS 的高表達(dá)密切相關(guān)[10]。RAF 進(jìn)一步促使MAPK 磷酸化信號級聯(lián)激活，誘導(dǎo)特定基因轉(zhuǎn)錄[8]。蛋白激酶MAPK 是RAS/RAF/MAPK 通路的核心成分，在細(xì)胞增殖、分化等程序中發(fā)揮重要作用[11]。闡明RAS/RAF/MAPK 通路的調(diào)控機(jī)制有助于明確腫瘤的發(fā)展機(jī)制。FGFR4 過表達(dá)可活化GRB2 和SOS 蛋白，進(jìn)而激活RAS/RAF/MAPK通路[12]。因此本研究探究下調(diào)FGFR4 基因的表達(dá)與RAS/RAF/MAPK 信號通路的調(diào)節(jié)作用及對口腔鱗癌增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 組織樣本、細(xì)胞株及主要試劑

收集本院于2018年4月至2019年8月收治的口腔鱗癌患者的32對腫瘤組織樣本和癌旁非癌組織。所有患者術(shù)后病理診斷為口腔鱗癌，術(shù)前未行化療或放療，具有完整病史記錄，且所有患者已簽署知情同意書。組織樣本均保存于-80℃，使用時同時處理腫瘤組織及非腫瘤樣本組織。人正常口腔上皮細(xì)胞HOEC購自上海弘順生物科技有限公司；人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27和HSC-2均購自上海酶研生物科技有限公司；SACC-83細(xì)胞購自江陰雨汐生物科技有限公司。胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基、qRT-PCR試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TRIzol試劑購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；Bcl-2、Bax、RAS、RAF、MEK、p-MEK、ERK1、p-ERK1和FGFR4抗體購自Abcam公司；二抗（羊抗兔）購自美國CST公司；顯影液和定影液購自碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常口腔上皮細(xì)胞HOEC 用RPMI-1640（15%胎牛血清）培養(yǎng)基在37 ℃、5 % CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；SACC-83 細(xì)胞用MEM（15%胎牛血清）培養(yǎng)基在37 ℃、5 % CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；CAL-27 細(xì)胞和HSC-2 細(xì)胞用DMEM（10%胎牛血清）在37 ℃、5 % CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

收集對數(shù)生長期SACC-83 細(xì)胞，以每孔3.5×106個細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)過夜培養(yǎng)。細(xì)胞分為3 組：空白組、siNC 組和siFGFR4 組。空白組細(xì)胞不作任何處理，siNC 組和siFGFR4 組細(xì)胞中分別將20 ng 的siNC 和siFGFR4 質(zhì)粒分別與15 μL 的LipofectamineTM2000 混合，加入孔內(nèi)，置于37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細(xì)胞。

1.4 qRT-PCR 檢測FGFR4 mRNA 表達(dá)水平

利用TRIzol 試劑提取細(xì)胞的RNA，RNA 樣品中加入100 μL 氯仿充分混勻后，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，上層液體中加入新無RNA 酶離心管，加入等體積異丙醇，混勻后-20℃靜置10 min，離心10 min，棄上清，加入無水乙醇清洗沉淀，重復(fù)清洗1 次，棄上清，加入20 μL RNase-free 水溶解RNA。反轉(zhuǎn)錄根據(jù)qRT-PCR 試劑盒說明進(jìn)行。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR 檢測，反應(yīng)體系為：cDNA 模板2 ng，上下游引物各0.4 μL，SYBR Primix Ex TaqTM5 μL，ddH2O 補(bǔ)充至10 μL。擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計算FGFR4 mRNA 的相對表達(dá)量。FGFR4 上游引物序列為5'-TCCTACCTGAGGATGCTGGCCGCT-3'，下游引物序列為5'-ACCGTCGGCTCCGAAGCTGCTGC CGA-3'；β-actin 上游引物序列為5'-CCGTTGCCC TGAGGCTCTTT-3'，下游引物序列為5'-GATCTG TCTGTCTTCTGTCTC-3'。

1.5 免疫印跡檢測FGFR4、Bcl-2、Bax、RAS、p-MEK和p-ERK1 蛋白表達(dá)水平

將RIPA 裂解液加入細(xì)胞中裂解蛋白，利用BCA 法檢測細(xì)胞蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離等量蛋白后轉(zhuǎn)膜。利用5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，加鼠抗人的Bcl-2、Bax、RAS、RAF、MEK、p-MEK、ERK1、p-ERK1 抗體（1∶2 000）和FGFR4 抗體搖床4℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min，4 次，加入HRP 標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶1 500）37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜5 min，4 次。顯影曝光后，通過Image-Pro Plus 系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，計算（目的蛋白/β-actin）的比值。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測FGFR4 的表達(dá)

將獲得的腫瘤組織樣本和癌旁非腫瘤組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，切片脫蠟后蒸餾水浸洗1 min 后，對切片進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%的過氧化氫于切片組織上，室溫孵育10 min，PBS 沖洗5 次，每次2 min。滴加稀釋好的山羊血清，孵育40 min，去除玻片周圍液體，滴加鼠抗人FGFR4 抗體，置于4℃孵育過夜。PBS 沖洗切片5 次，每次2 min，去除玻片周圍液體，滴加二抗37℃孵育25 min。PBS沖洗切片，滴加DAB 顯色液，自來水沖洗終止染色后，Harris 蘇木精復(fù)染45 s，水洗后用1%的鹽酸乙醇分化，再用自來水水洗返藍(lán)。將切片置于無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ脫水后，平置于通風(fēng)櫥晾干，鏡檢拍照。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SACC-83 細(xì)胞的增殖

胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計數(shù)。以每孔800 個細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，置于37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞，在6 孔板底部對單克隆細(xì)胞標(biāo)記。培養(yǎng)8 d 后觀察細(xì)胞，棄上清，PBS 洗滌細(xì)胞，加入1 mL 4%多聚甲醛，4℃固定細(xì)胞1 h，PBS 洗滌細(xì)胞，加入1 000 μL 結(jié)晶紫染色液作用細(xì)胞2 min，ddH2O 洗滌細(xì)胞，選取腫瘤豐富的區(qū)域，置于200×高倍鏡，胞質(zhì)或細(xì)胞核染成棕黃色表示為陽性細(xì)胞，200×鏡下計數(shù)400 個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計數(shù)值：陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%，重復(fù)5 次后取平均值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測SACC-83 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

將轉(zhuǎn)染siRNA 24 h的SACC-83細(xì)胞胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞后利用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞。在避光條件下，加入FITC-Annexin V和碘化丙鈉（PI），靜置15 min后，加入Binding Buffer混勻置于冰上，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。收集人口腔鱗癌細(xì)胞SACC-83，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為106/mL，加入70%乙醇固定細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞后，離心去除上清，加入RNase 37℃孵育30 min，加入碘化丙啶（PI），孵育15 min，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGFR4在口腔鱗癌組織及口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)

32 對樣本的免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR4 在正常口腔上皮組織中表達(dá)微弱，但在口腔鱗癌組織中過度表達(dá)（圖1A）。與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致，免疫印跡檢測顯示，腫瘤組織中的FGFR4 蛋白水平高于相應(yīng)的非癌組織（圖1B）。此外，與正常口腔上皮細(xì)胞HOEC 相比，在口腔鱗癌細(xì)胞系（HSC-2、CAL-27 和SACC-83）中檢測到不同程度的FGFR4 過表達(dá)（P<0.01）（圖1C、D）。SACC-83 細(xì)胞系中的FGFR4 蛋白表達(dá)水平較高，可作為以下研究基礎(chǔ)。

圖1 FGFR4 在口腔鱗癌組織和口腔鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)，標(biāo)尺=100 μm。A：免疫組織化學(xué)檢測FGFR4 的表達(dá)；B、C：免疫印跡檢測FGFR4 的表達(dá)；D：FGFR4/β-actin 比值，**P<0.01 vs HOEC.

2.2 沉默F(xiàn)GFR4 基因?qū)谇击[癌細(xì)胞增殖的影響

為了研究FGFR4 對口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響，將FGFR4 siRNA 轉(zhuǎn)染SACC-83 細(xì)胞24 h 后進(jìn)行qRT-PCR、免疫印跡和克隆形成實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與siNC 組（0.987±0.061）相比，si-FGFR4 組（0.305±0.015）的FGFR4 mRNA 相對表達(dá)量顯著降低（P<0.01）（圖2A）；免疫印跡檢測結(jié)果顯示，si-FGFR4 組的FGFR4 蛋白表達(dá)水平明顯低于siNC 組，說明siRNA 可以有效抑制FGFR4的表達(dá)（圖2B）。克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測沉默F(xiàn)GFR4基因?qū)ACC-83 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與siNC 組相比，si-FGFR4 組細(xì)胞克隆數(shù)減少約40.6%（P<0.01）（圖2C、D）。

圖2 沉默F(xiàn)GFR4 對口腔鱗癌細(xì)胞SACC-83 增殖的影響。A、B：SACC-83 細(xì)胞分別瞬時轉(zhuǎn)染NC siRNA 和FGFR4 siRNA，提取總RNA和細(xì)胞溶解產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后24 h 內(nèi)，用qRT-PCR 和免疫印跡檢測FGFR4 在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)（**P<0.01 vs siNC）；C、D：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測FGFR4 沉默后SACC-83 細(xì)胞增殖能力，**P<0.01 vs siNC.

2.3 沉默F(xiàn)GFR4 基因?qū)谇击[癌細(xì)胞凋亡的影響

為了研究FGFR4 對口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的影響，對已轉(zhuǎn)染FGFR4 siRNA 的SACC-83 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與siNC組相比，si-FGFR4 組細(xì)胞凋亡數(shù)目增加（P<0.01）（圖3A、B）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與siNC 組相比[Bcl-2 表達(dá)量為（0.812±0.120），Bax 表達(dá)量為（0.469±0.060）]，沉默F(xiàn)GFR4 抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)（0.378±0.080）（P<0.01），上調(diào)凋亡蛋白Bax 的表達(dá)（0.885±0.090）（P<0.01）（圖3C、D）。

圖3 沉默F(xiàn)GFR4 對口腔鱗癌細(xì)胞SACC-83 的凋亡影響。A、B：流式細(xì)胞術(shù)檢測FGFR4 對SACC-83 細(xì)胞凋亡的影響（**P<0.01 vs siNC）；C、D：免疫印跡檢測抗凋亡蛋白Bcl-2 和凋亡相關(guān)蛋白Bax 蛋白的表達(dá)（**P<0.01 vs siNC）.

2.4 沉默F(xiàn)GFR4 基因?qū)谇击[癌細(xì)胞周期的影響

為了研究FGFR4 基因?qū)谇击[癌細(xì)胞周期的影響，對已轉(zhuǎn)染FGFR4 siRNA 的SACC-83 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與siNC 組相比，轉(zhuǎn)染siFGFR4 使SACC-83 細(xì)胞在G0/G1 期停滯（圖4A）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)GFR4 抑制周期蛋白P21 的表達(dá)（P<0.05）（圖4B）。

圖4 沉默F(xiàn)GFR4 對口腔鱗癌細(xì)胞周期的影響

2.5 沉默F(xiàn)GFR4基因抑制RAS/RAF/MAPK信號通路

為了研究沉默F(xiàn)GFR4 對RAS/RAF/MAPK 信號通路的影響，將收集的已轉(zhuǎn)染FGFR4 siRNA的SACC-83 細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，siNC 組的EGFR 表達(dá)量為（0.732±0.210）、RAS為（0.634±0.080）、RAF 為（0.601±0.680）、p-MEK/MEK 為（0.768±0.410）、p-ERK1/ERK1為（0.753±0.540）；si-FGFR4 組的EGFR（0.197±0.280），RAS 表達(dá)量為（0.317±0.720）、RAF 為（0.309±0.620）、p-MEK/MEK 為（0.409±0.320）和p-ERK1/ERK1 為（0.325± 0.080）；較siNC 組顯著降低（P<0.05），說明沉默F(xiàn)GFR4 基因可抑制RAS/RAF/MAPK 信號通路（圖5A、B）。

圖5 沉默F(xiàn)GFR4 對RAS/RAF/MAPK 信號通路影響

3 討論

口腔鱗癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的40%[13]。與其他惡性腫瘤相比，口腔鱗癌的生存指數(shù)低、預(yù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移概率較高[14]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，每年口腔鱗癌的死亡人數(shù)高達(dá)14.5 萬[15]。盡管在預(yù)防和治療方面已取得相應(yīng)進(jìn)展，但口腔鱗癌診斷的延誤仍然是高發(fā)病率和高死亡率的主要原因之一[16]。因而，探究抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制，是解決當(dāng)前臨床口腔鱗癌防治的關(guān)鍵之一。

FGFR4 是高度保守的酪氨酸激酶受體家族成員之一，由一個細(xì)胞配體結(jié)構(gòu)域、單跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成[17]。在癌癥中，F(xiàn)GFR4 基因異常會影響FGFR4 蛋白的下游信號通路，導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。研究表明，F(xiàn)GFR4 是肝細(xì)胞癌的驅(qū)動因素[19]，F(xiàn)GFR4 可增加肺腺癌中表皮生長因子受體（EGFR）的致癌信號，阻斷FGFR4 可顯著抑制ESCC 的惡性行為[20]。此外，F(xiàn)GFR4 在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，是引起腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的原因[21]。這些研究表明，F(xiàn)GFR4 可能是一個促癌因子。Choi 等[22]報道FGFR4 單核苷酸多態(tài)性可作為預(yù)測口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的因素；Chia-Hsuan 等[23]報道FGFR4 的多態(tài)性與口腔鱗癌的易感性相關(guān)。這說明FGFR4 可能與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。然而，目前FGFR4 與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制的研究報道甚少。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR4在口腔鱗癌組織樣本和細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，暗示FGFR4 的高表達(dá)與口腔鱗癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)。研究顯示下調(diào)FGFR4 表達(dá)，會抑制口腔鱗癌細(xì)胞SACC-83 的增殖，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Bax 的表達(dá)，細(xì)胞凋亡的數(shù)目增加；此外，P21 蛋白表達(dá)降低。P21 是調(diào)控細(xì)胞周期的主要蛋白，通過與增殖細(xì)胞核抗原結(jié)合，抑制DNA 聚合酶復(fù)合物的形成，進(jìn)而影響細(xì)胞復(fù)制，阻滯細(xì)胞周期，特別是G0/G1 期[24]。本研究證實(shí)，下調(diào)FGFR4 表達(dá)，使SACC-83 細(xì)胞停滯于G0/G1 期。這說明在口腔鱗癌細(xì)胞SACC-83中，下調(diào)FGFR4 表達(dá)具有抑制其細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4 在口腔鱗癌細(xì)胞SACC-83 中發(fā)揮的功能與其在乳腺癌、肝癌、肺腺癌等癌癥中的生物學(xué)功能一致，具有明顯的促癌作用。

研究表明，腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的FGFR4 和Klotho 蛋白結(jié)合，與FGFR19 組成同源二聚體復(fù)合物，隨后激活RAS/RAF/MAPK 信號通路，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[25]。已有研究顯示，RAS/RAF/MAPK 信號通路與乳腺癌和直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[26-27]。白玥等[28]報道甲氨蝶呤通過RAS/MAPK 信號通路抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長；候曉潔等[29]報道華蟾毒配基聯(lián)合索拉非尼通過AURKA/RAS/RAF/ERK 信號通路影響肝癌Huh7 細(xì)胞增殖與凋亡。這些研究表明，RAS/RAF/MAPK 信號通路參與腫瘤發(fā)生發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化過程。本研究結(jié)果顯示，在口腔鱗癌細(xì)胞中下調(diào)FGFR4，降低RAS、p-RAF 和p-ERK1/2 蛋白的表達(dá)，提示下調(diào)FGFR4 的表達(dá)抑制口腔鱗癌中RAS/RAF/MAPK 信號通路的活化。之前的研究顯示，RAS/RAF/MAPK 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌、乳腺癌和直腸癌發(fā)展過程中被異常激活，而本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在口腔鱗癌細(xì)胞SACC-83 中RAS/RAF/MAPK 通路同樣被激活，也可能參與了癌細(xì)胞的發(fā)展，進(jìn)一步表明抑制該通路活化有可能成為癌細(xì)胞靶向治療的關(guān)鍵。

綜上所述，F(xiàn)GFR4 在口腔鱗癌組織和口腔鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)FGFR4 可抑制RAS/RAF/MAPK 信號通路的激活，進(jìn)而抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1 期，促進(jìn)其凋亡。以上結(jié)果初步明確FGFR4 在口腔鱗癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探索口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的思路。