紫花苜蓿花青苷合成的轉錄組分析

潘新怡，史 昆，龔 攀，韋 寶，吳欣明，王 贊*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所, 北京 100193；2.中國農業大學草業科學與技術學院, 北京 100193；3.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所, 山西 太原 030032)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，起源于“近東中心”，即小亞細亞、外高加索、伊朗和土庫曼的高地[1]。因其產量高、適口性好、消化率高、營養物質豐富，素有“牧草之王”的美稱。一直以來，紫花苜蓿不僅作為優質的飼草為家畜提供營養，還在生態環境建設中發揮著重要的作用。紫花苜蓿作為高度雜合的同源四倍體，具有自交不親和性，遺傳背景復雜等特點，使得其復雜數量性狀的研究相對較難。

花色素苷是花青素糖基化衍生物的總稱，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實等器官中，是植物的重要性狀，可以賦予植物顏色[2]，在植物傳粉、果實色澤、芳香氣味等方面也有重要的作用。植物花青素還具有較強的自由基清除能力[3]，在植物對生物和非生物脅迫響應中具有重要的作用，并且在人類疾病治療等方面也具有重要的作用[4]。目前，花青素調控網絡在葡萄風信子(Muscaribotryoides)[5-6]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[7]等花卉植物中的研究比較清晰，但在豆科牧草上的研究較少。花色作為重要的表型性狀，具有便于觀察，遺傳穩定等優點，常常作為育種工作的參考指標。紫花苜蓿的花一般以紫色、淺紫色為主，Barnes曾報道稀有的白花突變體存在[8]。我們在田間資源圃中發現來自哈薩克斯坦的紫花苜蓿野生材料中有一株白花突變體。但目前對于調控紫花苜蓿花色的研究較少，發掘調控花色的關鍵基因，探索紫花苜蓿花色苷形成的分子機制，對紫花苜蓿的相關性狀分子遺傳改良具有重要的意義。

在各種花色素苷的合成過程中，類黃酮羥化酶是合成花青素的一類關鍵酶，主要負責催化花瓣中產生不同的花青素類型，屬于細胞色素P450家族，包括類黃酮3′-羥化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)和類黃酮3′5′羥化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylases,F3′5′H)。其中，F3′5′H可以催化二氫黃酮醇B環3′5′位置發生羥基化，繼而DFR催化生成無色的花青素，再經花青素合成酶(Anthocyanidinsynthase,ANS)和類黃酮3-葡糖基轉移酶(Flavonoid 3-O-glucosyltransferase,3GT)催化形成藍色的翠雀素-3-葡糖苷，最終形成藍紫色的花翠素[9-10]。研究表明，百合(Liliumbrownii)和月季(Rosachinensis)等花卉植物，由于F3′5′H的缺失，導致無法積累花翠素，從而不能產生藍色品系[11]。在康乃馨(Dianthuscaryophyllus)和玫瑰(Rosarugosa)等植物中異位表達F3′5′H，都獲得了藍紫色新品系[12]。王宇塵等的研究發現在超表達F3′5′H基因的煙草(Nicotianatabacum)株系花瓣都出現紫紅色[13]，在黑果枸杞(Lyciumruthenicum)中F3′5′H基因的表達量高于在白色枸杞中的表達水平2 391倍左右[14]。另外，研究表明，黃酮醇合酶(Flavonol synthase,FLS)可以和DFR競爭性催化底物，減少藍色色素沉積，通過調節FLS和DFR的表達，可以改變葡萄風信子的藍色色素的沉積[15]。在植物中，花色苷的分解代謝途徑也被廣泛研究[16]，但是其分子機制尚不清楚，尤其是花色控制在不同物種中可以通過多種方式實現，例如在藍豬耳(Toreniafournieri)中，當查爾酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)和DFR基因共抑制后，藍豬耳產生白花和藍/白的花，而F3′5′H共抑制后則產生了粉紅色的花[17]，其調控機制尚不清晰。

轉錄因子，是調控基因表達的一類調控因子，通過調控一個或多個下游基因的表達，參與植物的生長、發育、代謝和耐逆性等生理過程中[18]。在花青素合成的途徑中，轉錄因子同樣發揮著關鍵的調控作用，研究表明(bHLH)/MYC，R2R3-MYB，WD40，WRKY，BZIP及MADS-Box等轉錄因子都參與花青素合成基因的轉錄調控[19]。其中，以MYB，bHLH，WD40形成的MBW復合體調控花青素合成酶基因的轉錄是最主要的一個途徑。Ben-Simhon等在石榴(Punicagranatum)上證實了PgWD40基因能與bHLH轉錄因子(PgAn1)和MYB轉錄因子(PgAn2)相互作用，共同調控下游結構基因DFR和無色花青素雙加氧酶(Leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX)的表達[20]。研究表明大麥(Hordeumvulgare)籽粒糊粉層中的藍色顆粒色素積累與MBW復合物相關[21]。葡萄(Vitisvinifera)中的VvMYBA2-VvMYC1可顯著增強類黃酮3-葡糖基轉移酶(Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase，VvUFGT)的表達，VvMYBA1-VvMYC1可顯著增強花青素還原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)和查爾酮異構酶(Chalcone isomerase, CHI)的表達，進而增加植物原花青素或花青苷的合成[22]。Qi等在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發現WD40/bHLH/MYB復合物可以相互作用，在茉莉酸的誘導下激活下游信號級聯反應，調控花青素的積累，進而增強植物應對外界不良環境的能力[23]。不但如此，單個類型的轉錄因子也可以調控關鍵合成酶基因的表達，其中MYB轉錄因子被報道在植物苯丙氨酸和類黃酮的生物調節途徑中發揮重要的功能[24]。ZmC1是植物中第一個鑒定的MYB家族的轉錄因子，參與調控玉米(Zeamays)的花青素表達[25]。在苦蕎(Fagopyrumtataricum)中過表達FtMYB1和FtMYB2能夠顯著增加原花青素的積累[26]。Takos等的研究表明蘋果(Malusdomestica)MdMYB1基因是調控蘋果果皮花色苷生物合成的關鍵基因[27]。

本研究以紫花苜蓿及其白花突變體為研究材料，進行RNA-Seq分析，探究可能影響紫花苜蓿花色形成的關鍵結構基因和調控基因，為紫花苜蓿花色調控分子機制提供基因資源并奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紫花苜蓿(‘ZW3236’)及其白花突變體，來自哈薩克斯坦野生紫花苜蓿材料，由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供。于2018年5月于山西省農業科學院畜牧獸醫研究所試驗基地取樣，在人工氣候室扦插培養(光照強度>450 μmol·m-2；溫度25℃；16 h光照/8 h黑暗；空氣濕度 60%～80%)，將扦插成活的苗子移栽至中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所昌平基地。在初花期時，分別采集紫花和白花2種材料的花作為試驗材料，每種材料設置3個生物學重復，采集好的樣品立即置于液氮中，然后放在-80℃冰箱保存待用。

1.2 總RNA提取、cDNA文庫構建及轉錄組測序

使用Eastep?Super總RNA提取試劑盒(購于Promega公司)提取花瓣RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，使用安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies,CA,USA)對RNA進行精確質檢。將合格的總RNA樣品送往銳博生物科技(廣州)有限公司進行測序，構建cDNA文庫，利用Illumina HiSeqTM-2500進行測序。

1.3 測序數據處理

測序所得的原始序列(Raw Reads)經過去接頭、去冗余處理，進一步拼接并對同源轉錄本進行聚類，得到最終的純凈序列，即高質量序列，以FASTQ文件格式儲存。后續所有的研究都是基于高質量序列進行。

1.4 基因功能注釋

以‘中苜1號’紫花苜蓿的基因組作為參考基因組(NGDC,https://bigd.big.ac.cn/)。利用軟件HISAT2(v2.2.0.4)將clean reads比對到參考基因組序列，使用Cufflinks(v2.1.1)軟件將比對結果組裝構建轉錄本，選擇最完整的轉錄本作為Unigene。使用Blast(v2.2.28)將Unigene序列與Nr(NCBI non-redundant protein sequences)，Nt(NCBI nucleotide sequences)，MTGD(Medicago truncatula Genome Database)，KOG(euKaryotic Ortholog Groups)等公共數據庫比對，匹配率≥70%且E-value≤1E-5，獲取Unigene注釋信息。

1.5 差異基因表達分析及功能富集

基因表達水平一般是通過該基因轉錄的mRNA的數量來衡量的，轉錄本豐度越高則基因表達水平越高。通過FPKM法來計算基因的表達量，即每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數目，通過FPKM值可直接表示差異基因的表達水平。差異基因篩選主要參考差異倍數(Fold change值)以及q值作為相關指標，以|log2Fold change|≥1和q <0.05的差異基因作為差異表達基因，使用DESeq進行差異基因分析，在基因本體數據庫(Gene ontology,GO)中對差異表達基因進行富集和功能注釋，并同時利用KOBAS(v2.0.12)軟件在京都基因與基因組百科全書數據庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)中搜索差異表達基因的KEGG注釋信息，確定差異表達基因參與的代謝途徑。

1.6 實時熒光定量PCR驗證

根據轉錄組數據分析，選擇12個與花青苷合成相關的差異轉錄因子，利用NCBI網站在線設計引物，進行實時熒光定量PCR驗證。以RNA樣品為模板，利用TRANSGENE One-Step反轉錄體系合成模板cDNA，以MsActin為內參基因，采用TRANS公司的PerfectStartTM Green qPCR SuperMix實時熒光定量試劑盒，利用ABI7500 Real-Time PCR system進行PCR擴增，采用2-ΔΔCT方法計算各基因的表達量[28]。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量分析

“紫花”和“白花”的RNA樣品經Illumina平臺測序后得到的原始序列為6 851.4～8 272.7萬條，經過濾和質控，分別得到了6 077.4～7 413.7萬條有效序列，占原始序列的88.7%～93.12%，Q30大于94.78%，說明測序質量較好，可進行后續分析。將獲得的clean reads比對到紫花苜蓿基因組，比對率為68.35%～74.19%，比對到基因組多個位置的序列占比為3.97%～4.47%，比對率相對較低的原因可能是由于紫花苜蓿遺傳背景復雜而導致的。

表1 樣品轉錄組數據統計

2.2 差異表達基因的篩選

通過比較兩種材料間的轉錄組數據，選取|log2Fold change|≥1并且q <0.05的基因作為顯著差異表達基因，使用DESeq進行差異基因分析。經篩選得到“白花”和“紫花”兩種樣品中的差異基因一共為4 857個，與紫花相比，白花中2 294個基因上調表達，2 563個基因下調表達，分別占差異基因數量的47.2%，52.8%，從圖1中可以看出兩組材料之間的基因表達水平具有顯著差異。

圖1 “紫花”和“白花”差異基因火山圖

2.3 差異表達基因的富集分析

2.3.1差異表達基因的GO富集分析 富集分析是全面描述生物體中基因及其產物屬性的分類系統。對獲得的基因進行GO注釋之后，按照基因參與的生物學過程(Biological process)、所處的細胞組分(Cellular component)及具有的分子功能(molecular function)等3個方面對基因功能進行分類。

如圖2所示，共分為54類，其中差異基因被注釋到23個生物學過程，17個細胞組分，14個分子功能中。細胞組分顯著富集在細胞膜和細胞器等5個組分類別；生物學過程主要顯著富集在代謝過程、細胞過程、對刺激的響應以及生物學調控等方面；分子功能分析中差異基因主要富集在催化活性和結合組分2方面。

圖2 “紫花”和“白花”差異表達基因的GO富集分析

2.3.2差異表達基因的KEGG富集分析 為了進一步研究差異基因所參與的代謝通路，利用MapMan工具對差異基因進行Pathway富集分析，差異基因被注釋到125條代謝通路中。進一步對KEGG中每個Pathway應用超幾何檢驗進行富集分析，發現這些基因顯著富集到6條代謝通路中，分別是苯丙氨酸生物合成途徑、角質層和蠟質層的生物合成、植物病原菌互作途徑、過氧化物酶體、脂肪酸降解以及α-亞麻酸代謝途徑。如圖3所示，苯丙氨酸途徑富集最顯著，包含了45個具有顯著差異的基因，其中20個基因顯著上調，25個基因顯著下調；其次是角質層和蠟質層的生物合成途徑，共包含24個差異顯著基因，其中11個基因上調表達，13個基因下調表達；過氧化物酶途徑中，共24個基因的表達具有顯著差異，其中10個基因顯著上調表達，其余基因顯著下調表達；α-亞麻酸代謝途徑中，6個基因顯著上調表達，10個基因顯著下調表達；脂肪酸降解途徑，共涵蓋16個差異表達基因，包括6個上調和10個下調表達的差異基因；植物病原菌互作途徑，共包括79個差異表達基因，30個基因顯著上調表達，49個基因顯著下調表達。

圖3 “紫花”和“白花”差異表達基因的KEGG pathway富集分析

類黃酮途徑是植物花青素合成中的關鍵通路。雖然類黃酮通路在KEGG富集分析結果中并未顯著富集，但本研究發現在類黃酮途徑中，合成花青素的關鍵合成酶基因DFR的表達量在“白花”中顯著低于“紫花”(圖4A)。qRT-PCR結果也表明，與“紫花”相比，白花突變體DFR的表達量降低了16倍左右，具有極顯著性差異，與轉錄組結果一致(圖4B)。因此，我們認為DFR表達量顯著下降可能是導致白花產生的主要原因。我們在PlantCARE中分析了DFR基因的啟動子，結果表明，在DFR啟動子中存在許多基序類型，其中存在大量的MYB以及MYB-like轉錄因子的結合基序(圖4C)，包括參與干旱脅迫的MYB結合位點GTCAAC(MBS和Myb)、參與光響應的MYB結合位點AACCTAA(MRE)，MYB及MYB-like結合基序CAACCA和TAACCA(MYB和MYB-like sequence)等。另外，在DFR的啟動子中還存在著5個MYC轉錄因子的結合位點，包括CATTTG，CAATTG和CATGTG(MYC)。

圖4 “紫花”和“白花”中DFR基因的表達量及啟動子分析

2.4 與類黃酮生物代謝發育相關的轉錄因子

關鍵合成酶基因的轉錄調控對花青苷的合成具有重要的調控作用，因此我們分析了2組材料間轉錄因子的差異表達情況。試驗中共預測出57個轉錄因子家族，共包含2 577個差異轉錄因子，其中1 173個轉錄因子上調表達，1 404個轉錄因子下調表達。數量最多的前十類轉錄因子家族分別為NAC，bHLH，B3，WRKY，C2H2，MYB-related，C3H，bZIP，M-type，MYB等，占總預測量的10.8%，8.3%，7.9%，5.9%，5.6%，5.1%，5.1%，4.8%，3.5%和2.9%，總計占總預測量的59.9%。在報道的調控花青素合成的轉錄因子中，R2R3-MYB，bHLH和WD40，可以單獨或形成復合體調控花青苷合成途徑中關鍵基因的表達，在花青苷合成中具有重要的作用[29]。因此，我們從差異表達的轉錄因子中挑選了5個MYB轉錄因子、5個BHLH轉錄因子、2個WD40轉錄因子進行實時熒光定量PCR驗證。結果如圖5所示，4個MYB轉錄因子、3個bHLH轉錄因子、以及2個WD40轉錄因子在2組材料中都具有極顯著性差異(圖5A-5C)。將qRT-PCR試驗中MYB，bHLH和WD40轉錄因子基因的表達量轉化為log2FC值，并與RNA-Seq測序得出的log2FC值進行相關性分析，結果表明2者之間顯著相關(R2=0.9267)，證明了轉錄組數據具有較高的準確性和可重復性(圖5D)。

表2 轉錄因子引物信息

圖5 實時熒光定量PCR驗證轉錄因子的表達量及其與RNAseq數據的線性回歸分析

3 討論

植物的花型、花色和花期在植物的有性世代過程中起著至關重要的作用。其中花的顏色在植物授粉媒介的交流過程中提供了重要的視覺信號，花色的改變可能會導致授粉媒介改變，進而影響植物授粉和種子形成[30]。花色主要由花青苷積累所導致，花青素的積累受一系列環境條件和發育信號的調控。花青苷作為一種有效的活性氧清除劑[31]，也是植物響應脅迫的重要物質[32]。可見，對于紫花苜蓿花色的研究不僅有助于我們了解紫花苜蓿花青苷形成的分子機制，在紫花苜蓿與環境因子間的互作和對生物與非生物脅迫的響應等方面都具有重要的意義。

本研究對紫花苜蓿及其白花突變體的花進行了轉錄組分析，共發現了4 857個差異表達基因，主要富集在代謝過程、細胞過程、對刺激的響應以及生物學調控等生物學過程及催化活性和結合組分2方面分子功能中。這些都表明了關鍵的花青苷合成代謝途徑及其關鍵基因轉錄調控的差異可能是產生白花突變體的主要原因。進一步差異表達基因的KEGG pathway富集分析結果表明苯丙氨酸途徑在2組材料間存在顯著差異，可能是引起花色喪失的一個原因。眾所周知，苯丙氨酸途徑是類黃酮途徑中第一步底物4-香豆酰CoA的來源[33]，因此白花突變體的產生可能是由于影響了最初底物的合成，從而造成顏色缺失。

類黃酮羥化酶是合成花青素的一類關鍵酶，其中F3′5′H在多種植物中都被報道是調控藍色花形成的主要結構基因[2]。例如，Guo等在大豆(Glycinemax)上證明了F3′5′H基因與大豆的花色相關，并開發了基因標記[34]。在藍色葡萄漿果中，F3′5′H/F3′H的比例較高，導致花翠素衍生物的產量高于紅色或白色品種[35]，類似結果在瓜葉菊(Pericallishybrid)和洋蔥(Alliumcepa)中也有報道[36]。本試驗轉錄組數據中，F3′5′H的表達量未有顯著性差異，表明F3′5′H可能不是產生白花突變體的主要原因，但這需要結合蛋白組和代謝組的相關研究進一步確定。

另外，DFR是類黃酮途徑中合成藍紫色花翠素的關鍵節點基因[37]。大量的研究結果表明，DFR功能缺失或表達量下降都會使得植物花色變白。例如，在葡萄風信子中DFR的下調是藍色色素減少，形成白色花的原因[5-6]。Yan等人在大豆上發現，大豆花色受編碼二氫黃酮醇4-還原酶2(DFR2)的w4位點的隱性等位基因(w4)控制，DFR2完全喪失功能導致大豆花色變白[38]。DFR基因在葡萄風信子中的表達具有組織特異性，與花青苷的積累高度協同，在月季花瓣上瞬時轉化DFR基因，該花瓣上出現了明顯的藍色斑塊[5]。此外，在2個不同顏色的海棠品種中，過表達DFR或沉默FLS會增加花青素的產生，從而導致海棠紅色葉片和紅色果皮的表型[39]。不僅如此，Qi等在枸杞上研究發現，CHS，CHI，F3′5′H，DFR，ANS和UFGT與黑果枸杞的花青素積累水平成顯著正相關，特別是F3′5′H和DFR表達水平分別比白色枸杞高2 391和85倍[14]。我們的研究中也發現在紫色花瓣中DFR的表達量顯著高于白色花瓣中，與上述報道結果一致，這可能是白花突變體產生的另一個原因。

轉錄因子在花青素合成途徑中也具有重要作用。其中，R2R3-MYB，bHLH和WD40，3種類型的轉錄因子可以通過形成MBW復合體，共同與結構基因的啟動子結合并誘導其表達，從而控制花青苷的合成[40]。尤其，MYB轉錄因子已經被廣泛報道參與花青苷的生物合成。例如，Jin研究表明，R2R3-MYB型轉錄因子PavMYB10.1與PavbH-LH和PavWD40蛋白相互作用，結合了花青素生物合成基因PavANS和PavUFGT的啟動子區域，決定了櫻桃(Prunuspseudocerasus)成熟期果皮的顏色[41]。李春燕在白羊草上挖掘了43個R2R3-MYB型轉錄因子，他們主要參與植物的生長發育、次生代謝和逆境相應等生物學過程[42]。Peng等在獼猴桃(Actinidiachinensis)中研究發現，MYB110轉錄因子在3個紫色獼猴桃的果皮中均有高表達，而在黃色獼猴桃品種中無表達；并且MYB110的過表達可以提高F3′5′H基因的表達，從而促進花翠素衍生物的形成，表明了MYB110可能是紫色獼猴桃形成的正調控因子[43]。Rinaldo等在葡萄上證實了VvMYBA1和VvMYBA2能夠激活葡萄中花青素的生物合成，是花青素合成、修飾和后期轉運的正向調節因子[44]。我們也分析了紫花苜類黃酮途徑中CHS，DFR，FLS和F3′5′H等基因的啟動子序列，結果發現，這些基因的啟動子區都不同程度的包含著MYB轉錄因子的結合位點或結合基序。尤其是具有顯著差異表達的DFR基因啟動子區域含有多個MYB，MBS以及MYB-Like Sequence等基序，這進一步表明MYB轉錄因子或者MBW復合物可能在紫花苜蓿花色形成中具有重要作用。轉錄組數據也表明，許多MYB，bHLH以及WD40等轉錄因子的表達量在兩組材料中具有顯著性差異，并且qPCR的結果與轉錄組數據基本一致，表明這些轉錄因子可能通過調控DFR基因的表達，從而控制紫色的形成，但這都需要進一步的試驗驗證和確認。

4 結論

本研究利用RNA-Seq技術，以紫花苜蓿及其白花突變體為研究材料，探究2種材料在轉錄水平上的差異，結果表明，紫花和白花之間共有差異表達基因4 857個，其中上調基因2 294個，下調基因2 563個；通過對差異表達基因的分析，初步確認了可能影響紫花苜蓿花色形成的結構基因和轉錄因子，研究發現類黃酮合成通路中關鍵基因DFR在白花突變體中的表達量顯著性下調，其啟動子中存在大量的MYB類轉錄因子的結核基序，以及5個MYC轉錄因子的結合位點，并且轉錄組學和熒光定量PCR等結果均表明MYB轉錄因子或MBW復合物可能通過調控DFR基因的轉錄進而影響紫花苜蓿花色素苷的形成，這將為紫花苜蓿花色形成機制的研究提供一定的理論基礎，對全面了解紫花苜蓿花色調控的分子機制具有重要意義。