杧果RAV基因家族的全基因組分析

孫宇 劉志鑫 葉子 羅睿雄 劉曉妹 蒲金基 張賀

摘要： 為了揭示RAV家族基因在杧果中的序列特征及其表達特性，采用生物信息學方法對杧果RAV家族基因進行序列分析，并通過qRT-PCR技術研究杧果膠孢炭疽菌和細菌性黑斑病菌侵染過程中該家族基因的相對表達量。結果表明，從杧果基因組中鑒定出6個RAV基因家族成員，其編碼的蛋白質均具有AP2和B3超家族保守域結構，命名為MiRAV1～MiRAV6。MiRAV1和MiRAV5為不穩定親水堿性蛋白質，MiRAV2和MiRAV3為不穩定親水酸性蛋白質，MiRAV4為穩定親水酸性蛋白質，MiRAV6為穩定親水堿性蛋白質。杧果RAV基因編碼的蛋白質主要定位于細胞核中，無規則卷曲和α-螺旋是6個MiRAVs蛋白二級結構的主要元件。系統進化樹結合基序分析結果表明，在杧果與擬南芥、煙草、蘋果、菠蘿和毛果楊中，RAV家族基因具有多樣性，在進化上結構具有保守性。qRT-PCR結果顯示，膠孢炭疽菌侵染過程中，杧果RAV基因的相對表達量均顯著下調;細菌性黑斑病菌侵染過程中，MiRAV1～ MiRAV6的相對表達量在3 h時均顯著下調，MiRAV1、MiRAV2、MiRAV3和MiRAV6的相對表達量在6 h時均顯著上調，MiRAV1、MiRAV5和MiRAV6的相對表達量分別在12 h、24 h、48 h、72 h時均顯著上調。以上發現將為研究杧果RAV基因家族成員的功能和作用機制奠定基礎。

關鍵詞： 杧果;RAV基因家族;全基因組鑒定;表達分析

中圖分類號： S667.7?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2021）04-0957-11

Genome-wide analysis of the RAV gene family in mango

SUN Yu1，2， LIU Zhi-xin2， YE Zi1，2， LUO Rui-xiong3， LIU Xiao-mei1，2， PU Jin-ji1，2， ZHANG He1，2

（1.College of Plant Protection， Hainan University， Haikou 570228， China;2.Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou 571101， China;3.Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China）

Abstract： In order to reveal the sequence and expression characteristics of RAV gene in Mangifera indica， the sequence of the RAV gene family was analyzed using bioinformatics methods， and the relative expression level of RAV gene family was studied by qRT-PCR during the infection of Colletotrichum gloeosporioides and Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae. The results showed that six RAV gene family members were identified from the mango genome， and the encoded proteins had the conserved domains of the AP2 and B3 superfamily， named MiRAV1-MiRAV6. MiRAV1 and MiRAV5 were unstable hydrophilic basic proteins， MiRAV2 and MiRAV3 were unstable hydrophilic acidic proteins， MiRAV4 was a stable hydrophilic acidic protein， and MiRAV6 was a stable hydrophilic basic protein. The proteins encoded by RAV gene of mango were mainly located in the nucleus， and random coil and α-helix were the main elements of secondary structure of six MiRAVs proteins. Phylogenetic tree construction combined with motif analysis showed that， among mango and Arabidopsis thaliana， tobacco， apple， pineapple and Populus tomentosa， the RAV family genes were diverse and their structure was conservative in evolution. The results of qRT-PCR indicated that the relative expression of RAV gene in mango was significantly down regulated during the infection of Colletotrichum gloeosporioides. During the infection of Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae， the relative expression levels of MiRAV1-MiRAV6 were significantly down regulated at 3 h， and the relative expression levels of MiRAV1， MiRAV2， MiRAV3 and MiRAV6 were significantly up-regulated at 6 h， and the relative expression levels of MiRAV1， MiRAV5 and MiRAV6 were significantly up-regulated at 12 h， 24 h， 48 h and 72 h， respectively. These results will lay a foundation for further study on the function and mechanism of RAV gene family members in mango.

Key words： mango;RAV gene family;genomic identification;expression analysis

轉錄因子，又稱反式作用因子，其具有特殊的結構可調控基因表達，是植物中重要的調控因子。植物轉錄因子在脅迫反應中，對調控基因表達發揮重要作用[1-3]，當植物受到逆境脅迫時，轉錄因子與相應的順式作用元件結合，可以調控下游相關基因的表達 [4]。RAV（Related to AB13/VP1）轉錄因子廣泛存在于植物中，該家族同時具有2個保守結構域[5-8]：位于N端，可與GCC-box區域特異性結合的AP2結構域;位于C端，可與CACCTG序列特異性結合的B3結構域[9]。VP1/ABI3以及ARFs轉錄因子家族都具有該結構域，主要調控植物對生長素和脫落酸的反應[10]。RAV屬于AP2/ERF家族的一個亞家族，該家族還包含ERF、AP2、DREB亞家族[11]。

迄今為止，RAV基因家族成員已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[12-13]、黃瓜（Cucumis sativus）[14]、棉花（Gossypium）[15]、東方山羊豆（Galega orientalis）[16]、煙草（Nicotiana tabacum）[17]、茶樹（Camellia sinensis）[18]等植物中被陸續克隆和鑒定。例如：在擬南芥中發現7個RAV基因家族成員AtRAV1～AtRAV7，AtRAV1和AtRAV2在擬南芥中參與應對外界脅迫和葉片衰老 [12-13];黃瓜中CsRAV在各個組織中均有表達[14];棉花中GhRAV表達受黃萎病菌的誘導[15];東方山羊豆中GoRAV表達不僅受低溫和聚乙二醇的誘導，還受茉莉酸甲酯、水楊酸和脫落酸的誘導[16];煙草中GmRAV過量表達會導致葉片失綠，同時抑制植株的生長 [17];茶樹中CsRAV表達受NaCl、乙烯和低溫的誘導[18]。RAV基因廣泛的分布表明它們在植物的生長發育和抗逆反應調控過程中起著非常重要的作用。

杧果（Mangifera indica），被稱為熱帶水果之王，是熱帶地區重要的果樹，也是農民脫貧致富的“金杧果”和“致富樹”。隨著2020年杧果全基因組測序的完成 [19]，杧果基因功能的研究進程明顯加快，然而目前國內外對杧果RAV基因家族的研究還未見報道。為此，本研究對杧果RAV基因家族成員的序列特征及其表達特性進行分析，為杧果基因功能的分析以及杧果的遺傳育種等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 杧果生物脅迫處理

杧果嫁接苗由農業農村部儋州杧果種質資源圃提供，品種為貴妃杧。將株高約60 cm，均勻一致，樹齡1年的杧果嫁接苗移栽到花盆內，以室溫25 ℃，相對濕度70%～90%，光周期12 h（光）/12 h（暗）的條件下進行生物脅迫處理。設置膠孢炭疽菌和細菌性黑斑病菌 2個處理，每個處理3株苗，處理0 h作為對照。以分生孢子含量為1 ml 2×106 個的膠孢炭疽菌分生孢子懸浮液、含量為2×107CFU 的細菌性黑斑病菌懸浮液分別對杧果嫁接苗葉片均勻噴霧，取樣時間分別為0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，將杧果葉片剪碎，液氮速凍，-80 ℃保存待用。

1.2 杧果全基因組數據的來源

杧果全基因組數據來源于NCBI（PRJNA487154），擬南芥、煙草、蘋果（Malus domestica）、菠蘿（Ananas comosus）、毛果楊（Populus trichocarpa）5個物種的基因組和RAV基因信息分別來源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/）數據庫。

1.3 杧果RAV基因家族成員的鑒定

從擬南芥數據庫獲取AtRAV1～AtRAV7氨基酸序列，并將其作為查詢對象在杧果基因組數據庫中執行Blastp比較（E≤10-10）。使用Pfam工具（http：//pfam.xfam.org/）檢測得到的杧果蛋白質氨基酸序列結構域，進一步去除沒有典型AP2和B3結構域的蛋白質氨基酸序列，最終得到所有杧果RAV基因家族成員[20]。其他5個物種中的RAV基因家族成員采用類似的方法進行篩選。

1.4 杧果RAV基因家族的生物信息學分析

通過在線工具ProtParam預測RAV相對分子質量、等電點、外顯子數、脂溶指數、氨基酸數等理化性質[21];利用PSORT在線軟件進行亞細胞定位預測;通過SOPMA在線軟件預測蛋白質的二級結構;利用NCBI Conserved Domain Search預測RAV的保守結構域，再通過SWISS-MODEL在線工具對蛋白質保守域的三級結構進行預測;利用MEME在線軟件對杧果RAV家族的蛋白質保守基序進行分析[22]，再通過DNAMAN 6.0軟件進行高同源蛋白的氨基酸序列比對。

1.5 系統進化樹分析

利用ClustalW程序對杧果和擬南芥、煙草、蘋果、菠蘿、毛果楊的RAV家族成員的氨基酸序列進行多序列比對。獲得RAV蛋白氨基酸序列后使用MEGA 7.0軟件，通過鄰近法構建進化樹，其中校驗參數Bootstrap值設置為1 000次重復[23]。

1.6 RNA提取及cDNA合成

杧果葉片總RNA提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司產品）說明書中的方法。利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄成第1鏈cDNA [24]。

1.7 杧果RAV基因家族表達分析

利用 QuantStudio 6 Flex的實時熒光定量PCR檢測系統檢測膠孢炭疽菌和細菌性黑斑病菌侵染下杧果RAV家族基因的表達量，引物見表1。反應體系為18.0 μl，設置2個復孔。反應程序參照UltraSYBR Mixture試劑盒說明書（北京康為世紀生物科技有限公司產品）進行設置。以杧果MiActin作為內參基因，0 h的表達量為對照，運用2-△△Ct法進行數據統計，確定MiRAV1～MiRAV6的相對表達量[25]，并通過HemI 1.0.3.7軟件繪制熱圖，其中設置膠孢炭疽菌相對表達量熱圖參數（條形圖的數量）為11，小數點位數值為2，最小值為-20，階躍值為2;設置細菌性黑斑病菌相對表達量熱圖參數（條形圖的數量）為11，小數點位數值為2，最小值為-2，階躍值為2。整個表達矩陣每個值進行對數轉化，底數為2。

2 結果與分析

2.1 全基因組水平鑒定杧果RAV基因家族成員

在杧果基因組數據庫中進行Blastp檢索，發現杧果RAV基因家族有6個成員，分別命名為MiRAV1～MiRAV6。通過生物學在線分析工具ProtParam對杧果RAV基因家族6個成員MiRAV1～MiRAV6編碼的蛋白質氨基酸序列的理化性質進行了分析，結果（表2）表明，6個MiRAVs蛋白相對分子質量為32 523 340～44 122 280，蛋白質等電點為5.83～9.34，外顯子數均為2，脂溶指數為58.93～74.31，氨基酸數為281～392個，不穩定指數為34.14～46.61，親水性平均數為-0.506～-0.863。因此，預測這6個MiRAVs蛋白中MiRAV1和MiRAV5為不穩定親水堿性蛋白質，MiRAV2～MiRAV3為不穩定親水酸性蛋白質，MiRAV4為穩定親水酸性蛋白質，MiRAV6為穩定親水堿性蛋白質。

對杧果RAV家族成員進行亞細胞定位預測，結果（表3）顯示，它們主要定位于細胞核中，其次定位于葉綠體和細胞質中，推斷該家族成員主要存在于進行光合作用的器官中。其中，只有MiRAV1和MiRAV4沒有定位于葉綠體，MiRAV4和MiRAV6沒有定位于細胞質，線粒體、過氧化氫酶體，質膜定位的MiRAVs成員最少。

通過SOPMA在線軟件對MiRAV1～MiRAV6蛋白進行二級結構預測。如圖1所示，6個MiRAVs蛋白無規則卷曲結構占比為44.58%～54.85%，α-螺旋結構占比為21.88%～31.67%，延伸鏈結構占比為16.86%～19.13%，β-轉角結構占比為4.85%～7.56%。因此，預測無規則卷曲和α-螺旋是6個MiRAVs蛋白二級結構的主要元件，其次是延伸鏈和β-轉角。

通過NCBI Conserved Domain Search對杧果RAV家族蛋白質氨基酸序列進行保守結構域分析，發現MiRAV1～MiRAV6蛋白均含有AP2和B3超家族保守域（圖2）。6個MiRAVs蛋白AP2超家族保守域位置介于18～124;B3超家族保守域位置介于137～291。基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL軟件對杧果RAV蛋白的2個保守結構域（AP2、B3）三級結構進行預測，發現在AP2保守結構域中，含有1個 α-螺旋和3個反向平行的β-轉角;B3保守結構域中，含有1個α-螺旋、2個反向平行的β-折疊和延伸鏈。

2.2 杧果RAV蛋白系統進化樹分析

為了更好地了解杧果RAV基因家族的系統發育關系，將杧果（6個）、擬南芥（7個）、煙草（5個）、蘋果（11個）、菠蘿（2個）、毛果楊（5個）RAV基因編碼的蛋白質氨基酸序列通過Blast工具進行蛋白質氨基酸序列分析，利用ClustalW程序和MEGA 7.0軟件構建6個杧果RAV蛋白與其他物種（共5種）植物RAV蛋白系統進化樹（圖3），將36個RAV成員分成3個分支（Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ），結果顯示，6個物種的RAV蛋白家族成員相互嵌合在一起，表明植物RAV在進化過程中相對保守。每個分支中均存在2個杧果RAV成員，其中，Class Ⅰ包含杧果2個、擬南芥2個、毛果楊3個、蘋果5個和煙草1個;Class Ⅱ包含杧果2個、蘋果4個、菠蘿2個和擬南芥5個;Class Ⅲ包含杧果2個、毛果楊2個、煙草4個和蘋果2個。在36個RAV成員中，MiRAV1、MiRAV6分別與MDP0000128924、MDP0000939633親緣關系最近，MiRAV2、MiRAV3分別與AtRAV1、AtRAV7親緣關系最近，MiRAV4與MDP0000207722、MDP0000485280親緣關系最近，MiRAV5與Potri.018G109200.1、Potri.018G109200.2親緣關系最近。因此，推測RAV家族蛋白質不僅具有多樣性，對于親緣關系較近的蛋白質，它們還具有相似或相近的生物學功能。

2.3 杧果RAV家族蛋白質motif和保守結構域分析

基于在線軟件MEME對杧果、擬南芥、煙草、蘋果、菠蘿、毛果楊RAV轉錄因子家族的蛋白質保守基序進行分析（圖4），在RAV轉錄因子家族中鑒定出5個保守基序，主要的保守基序有4個（motif1～motif4），N端均存在保守的motif1，C端均存在保守的motif2。其中，MiRAV4～MiRAV5、AtRAV3～AtRAV4、MDP0000526584、MDP0000534780、MDP0000165802、MDP0000207722、MDP0000485280、Potri.018G109200.1、Potri.018G109200.2、Potri.003G212800.1、XP_016492322.1不含有motif5。通過基序分析發現，RAV基因家族在進化上結構具有保守性。

通過DNAMAN 6.0軟件對杧果6個RAV蛋白和擬南芥7個、煙草5個、蘋果11個、菠蘿2個、毛果楊5個RAV蛋白進行多序列比對。結果（圖5）發現，MiRAV1～MiRAV6與5個物種的RAV轉錄因子家族存在2個相似的保守域A和保守域B，保守域A與motif1 基本重疊，保守域B與 motif2、motif3 基本重疊。因此，可以推測motif1、motif2和motif3是構成AP2、B3結構域的主要結構。

2.4 杧果RAV基因家族的脅迫響應

以杧果MiActin作為內參基因，0 h處理作為對照，利用qRT-PCR檢測并分析了2種病原菌侵染過程中杧果RAV家族基因的表達程度。qRT-PCR結果顯示，MiRAV1～MiRAV6和內參基因MiActin的熔解曲線為單峰，熔解溫度分別為81.69 ℃、74.15 ℃、71.79 ℃、73.75 ℃、77.79 ℃、80.52 ℃、83.73 ℃，將qRT-PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，結果（圖6）顯示，目標條帶單一，清晰，與預計大小一致，說明所設計的引物具有特異性;杧果膠孢炭疽菌侵染過程中（圖7A），MiRAV1～MiRAV6的相對表達量均顯著下調，其中MiRAV1～MiRAV6相對表達量在6 h時達到最低值，MiRAV1～MiRAV5的相對表達量在72 h時達到最高值，MiRAV6的相對表達量在48 h時達到最高值;杧果細菌性黑斑病菌侵染過程中（圖7B），MiRAV1～ MiRAV6的相對表達量在3 h時均顯著下調，MiRAV1、MiRAV2、MiRAV3和 MiRAV6的相對表達量在6 h時顯著上調，MiRAV1、MiRAV5和 MiRAV6的相對表達量分別在12 h、24 h、48 h、72 h時均顯著上調。結果表明，在不同病原菌侵染過程中，MiRAV1～ MiRAV6的相對表達量與對照差異顯著。

3 討論

基因組測序技術的提高和分子生物學研究的深入，為植物基因家族的鑒定、功能基因的挖掘提供了基礎，大量植物全基因組已經被成功測序。RAV家族是一類植物特異的轉錄因子，廣泛存在于植物細胞內。在擬南芥[12-13]、黃瓜[14]、棉花[15]、東方山羊豆[16]、煙草[17]、茶樹[18]等中關于RAV已開展相應研究，主要體現在參與應對外界脅迫和葉片衰老等方面功能，但關于其杧果RAV轉錄因子家族的研究至今仍未見報道。

本研究在杧果全基因組水平鑒定到6個RAV基因，理化性質分析結果表明，MiRAV1和MiRAV5為不穩定親水堿性蛋白質，MiRAV2和MiRAV3為不穩定親水酸性蛋白質，MiRAV4為穩定親水酸性蛋白質，MiRAV6為穩定親水堿性蛋白質。杧果RAV蛋白主要存在于細胞核中，無規則卷曲和α-螺旋是6個MiRAVs蛋白二級結構的主要元件，均具有AP2和B3超家族保守域結構，AP2保守域三級結構含有1個 α-螺旋和3個反向平行的β-轉角，B3保守域三級結構含有1個 α-螺旋、2個反向平行的 β-折疊和延伸鏈，據此推斷它們在調控生物性狀上存在協同作用。杧果與擬南芥、煙草、蘋果、菠蘿、毛果楊RAV蛋白家族構建系統進化樹結合基序分析結果顯示，6個物種的RAV蛋白家族成員相互嵌合在一起，表明植物RAV基因在進化過程中相對保守;在模式植物擬南芥中參與應對外界脅迫和葉片衰老的基因AtRAV1和AtRAV2被聚類到ClassⅡ中，因此，推斷該ClassⅡ分支下的杧果MiRAV2和MiRAV3基因可能與應對外界脅迫和葉片衰老有關[12-13];對于親緣關系較近的蛋白質，推斷它們還具有相似或相近的生物學功能;杧果RAV蛋白主要的保守基序有4個（motif1～ motif 4），N端均存在保守的motif1，C端均存在保守的motif2，motif1～ motif 3與盧合均等[15]研究棉花時所鑒定到的motif1～motif3基本一致，motif1與韓林賀等[26]研究普通煙草時所鑒定到的motif1基本一致;杧果與其他5個物種RAV蛋白進行多序列比對結果顯示，存在2個明顯的保守域A和保守域B，保守域A與motif1基本重疊，保守域B與motif2、motif3基本重疊，因此，可以推測motif1是構成AP2的主要結構，motif2和motif3是構成B3的主要結構。

中國杧果病害危害嚴重，常見的病害有炭疽病、細菌性黑斑病、白粉病、蒂腐病、瘡痂病等[27-28]，其中，杧果膠孢炭疽病與細菌性黑斑病為害杧果最為嚴重[29-30]。為了解杧果RAV基因在膠孢炭疽菌與細菌性黑斑病菌侵染下相對表達量的變化，對杧果葉片進行膠孢炭疽菌與細菌性黑斑病菌生物脅迫處理，并通過qRT-PCR技術研究膠孢炭疽菌與細菌性黑斑病菌侵染過程中杧果RAV家族基因的相對表達量。結果顯示，在不同病原菌侵染過程中，MiRAV1～MiRAV6的相對表達量與對照差異顯著，表明MiRAV1～MiRAV6對生物脅迫有響應。RAV基因家族的表達分析研究，更多集中在MeJA[16]、NaCl[18]、ABA和低溫[26]等非生物脅迫上，也有前人在研究中提到RAV基因對棉花黃萎病菌[15]、番茄青枯病菌[31]等生物脅迫的響應，本研究通過對杧果接種膠孢炭疽菌與細菌性黑斑病菌后的分析，發現了此家族的部分成員在膠孢炭疽菌與細菌性黑斑病菌侵染植株之后出現上調表達的現象， 表明RAV基因可能在杧果提高抗炭疽病和細菌性黑斑病的能力方面起著積極作用，如MiRAV1、MiRAV5、MiRAV6在細菌性黑斑病菌侵染后的12～72 h顯著上調表達，可以作為后續研究杧果抗細菌性黑斑病機制的候選基因，這也在分子水平上拓寬了杧果響應生物脅迫的機制。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-11-25

基金項目：國家重點研發專項（2019YFD1000504）;中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項（1630042017019）

作者簡介：孫 宇（1995-），男，海南三亞人，碩士研究生，研究方向為植物保護。（E-mail）sunyuqp@qq.com

通訊作者：張 賀，（E-mail）atzzhef@163.com;蒲金基，（E-mail）cataspjj@163.com