半夏-陳皮“異病同治”咳嗽和冠心病的網絡藥理學作用機制研究*

萬陽 楊奕 劉慧瑩 蔡恒斌 李金根 毛祥坤#

（1江西中醫藥大學 南昌330004；2江中藥業股份有限公司 江西南昌330077；3江西省南昌市強制隔離戒毒所 南昌330029）

咳嗽是一種呼吸道常見疾病，占呼吸科門診的30%左右，病因復雜，部分患者經抗感染治療后仍無法緩解，長此以往，若得不到有效治療，將對呼吸系統造成損傷[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而致，臨床常見冠心病患者易患咳嗽，西醫認為與患者心肺功能不全有關[2]。從中醫角度而言，咳嗽病位在肺，因肺失宣肅、肺氣上逆、沖擊氣道而致，臨床可表現為咳嗽、咳痰，分外感與內傷兩種，其中外感咳嗽若不能及時使邪外出，易演變為內傷咳嗽，內傷咳嗽其病理因素多與“痰”相關。冠心病屬中醫的“胸痹、胸痛”等范疇，病位在心，病理因素與“痰、瘀血”相關。“心為君主之官、肺為相傅之官”，肺能協助“君主之官”調節氣血，兩者發病亦與“痰”相關，故咳嗽、冠心病在病因病機上常互為關聯。半夏、陳皮為臨床常用祛痰藥，兩者常相須為用，作為治療呼吸、心血管疾病的中藥復方核心藥在臨床上應用廣泛[3]。中醫治病的法則，不著眼于疾病的異同，關鍵在于其病機的異同，“異病同治”則是該法則的主要體現。在不同疾病的發生發展過程中，只要出現相同的病機，就可以采用同一方法治療該病。咳嗽、冠心病在發病過程中，常出現“痰濁阻滯”，用半夏-陳皮藥對治療符合“異病同治”之說。網絡藥理學是很多學者近年提出的一種采用系統生物學方法來進行藥理學研究的新型技術方法，是基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用的網絡，能系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，這與中藥的多成分、多途徑、多靶點協同作用的原理相似[4]。基于此，本研究運用網絡藥理學方法，從中醫“異病同治”的角度，探究半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病的具體分子機制。現報道如下：

1 研究方法

1.1 藥物成分及靶點的查詢及篩選 在TCMSP數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%或類藥性指數（Drug Like Index,DL）≥0.18為標準對中藥藥對半夏-陳皮的化合物進行篩選[5]。將符合條件的化合物輸入Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找其國際化學標識符（International Chemical Identifier,InChI）及CID，并將其輸入BATMAN-TCM數 據 庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中，以得分（Score）≥20與調整P值（Adjusted P-value）＜0.05為臨界值進行藥物靶標的篩選[6]。

1.2 疾病基因的檢索 分別在基因疾病關聯數據庫DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）、人類孟德爾遺傳綜合數據庫OMIM（https://www.omim.org/）、藥物靶標數據庫Drug Bank（https://www.drugbank.ca/）以咳嗽（Cough）、冠心病（Coronary Heart Disease）為詞條進行相關疾病基因檢索。將所得的咳嗽、冠心病疾病基因進行整合，并應用Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）對基因進行標準化。

1.3 構建半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標數據庫PPI網絡圖 將半夏和陳皮中篩選所得的藥物靶標分別與咳嗽、冠心病的疾病基因進行映射，分別得出該藥對治療咳嗽、冠心病的靶標。將兩個數據集進行整合得到該藥對治療咳嗽和冠心病的共同作用靶基因，合并抽取交集靶基因，得出該藥對疾病共同作用的靶標蛋白數據庫。將靶標蛋白輸入STRING數據庫（https://string-db.org），構建PPI網絡，用Cytoscape軟件（3.8.2）進行可視化分析。根據Cytoscape軟件中的Network Analysis plugin插件對圖中節點自由度（Degree）進行分析。自由度越大，該節點在網絡中的生物功能則越多。根據節點自由度大小進行顏色渲染，顏色由黃色漸變成紅色。其中黃色節點表明其Degree較小（生物功能較少），紅色節點代表其自由度較大（生物功能較多）。

1.4 基 因 本 體（Gene Ontology,GO）、KEGG PATHWAY通路富集 分別將半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病及其交集靶基因輸入DAVID數據庫分別進行GO、KEGG分析，以P值＜0.05為標準進行篩選。

1.5 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病“活性成分-靶標”網絡可視化構建 分別將半夏-陳皮作用咳嗽、冠心病的有效作用成分、潛在靶標輸入Cytoscape3.8.2 軟件，構建“活性成分-靶標”網絡圖。

2 結果

2.1 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病靶標 基于DisGeNET、OMIM及Drug Bank數據庫查詢所得，有230個基因與咳嗽相關，1 658個基因與冠心病相關。經過分析后發現藥對半夏-陳皮治療咳嗽的基因有49個、有效成分69個，治療冠心病的基因有342個，有效成分87個。

2.2 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標數據庫PPI網絡圖 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標共有24個，將其輸入STRING數據庫構建PPI網絡圖，發現除TBPL1之外，其余23個靶標蛋白之間均可相互作用。將23個靶蛋白輸入Cytoscape軟件進行可視化，PPI網絡圖顯示共有23個節點，聚類系數為0.597，網絡密度為0.372，其中生物功能最多的前3個靶標蛋白人白介素1B（IL1B）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素8（CXCL8）。見圖1、圖2。

圖1 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因韋恩圖

圖2 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因PPI網絡圖

2.3 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因GO分析 用DAVID 6.8數據庫分別對半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病及其交集靶標進行GO在線富集，經過篩選后發現：藥對治療咳嗽的生物過程（Biological Process,BP）主要集中在炎癥反應、對基因表達的正向調控、蛋白質四聚體等方面，細胞組成（Cellular Component,CC）主要集中在胞外部分、細胞表面、細胞質膜的整體組成等，分子功能（Molecular Function,MF）主要表現細胞因子活性、離子通道的活性、鈣離子通道活性等方面。中藥藥對治療冠心病BP主要集中在對藥物反應、炎癥反應、對脂多糖的反應等部分，CC主要集中在細胞外部分、細胞質及細胞表面等，MF主要集中在酶結合、細胞因子活性、受體結合等方面。半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶標BP主要集中在炎癥反應、對基因表達的調控、對鈣二醇1-單加氧酶活性的正向調控等方面，CC主要集中在細胞外部分、細胞表面、細胞膜等，MF主要表現在細胞因子活性、蛋白質同源二聚體活性、酶結合等方面。見表1~3。

表1 半夏-陳皮治療咳嗽靶基因GO分析

表2 半夏-陳皮治療冠心病靶基因GO分析

表3 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因GO分析

續表

2.4 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因KEGG分析KEGG PATHWAY通路富集分析發現，中藥對治療咳嗽的主要通路涉及TNF通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體通路等25個通路。藥對治療冠心病的主要通路涉及HIF-1通路、TNF通路、AMPK通路等127個通路。半夏-陳皮“異病同治”的主要信號通路涉及NOD樣受體信號通路、TNF通路、NF-κB通路、TGF-β通路等炎癥相關信號通路。見圖3、圖4、圖5。

圖3 半夏-陳皮治療咳嗽靶基因KEGG PATHWAY富集圖

圖4 半夏-陳皮治療冠心病靶基因KEGG PATHWAY富集圖

圖5 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因KEGG PATHWAY富集圖

2.5 半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病“活性成分-靶標”圖 分別將半夏-陳皮藥對治療咳嗽、冠心病的有效活性成分、潛在作用靶標及其通路輸入Cytoscape 3.8.2軟件，設置節點Degree≥10為標準進行篩選，構建“重要活性成分-靶標”網絡圖，圖中棱形節點代表小分子化合物，圓形節點代表潛在靶點。見圖6、圖7。

圖6 半夏-陳皮治療咳嗽“重要活性成分-靶標”圖

圖7 半夏-陳皮治療冠心病“重要活性成分-靶標”圖

3 討論

半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，味辛、性溫，歸脾、胃、肺經，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效，現代藥理學研究發現其具有止咳平喘、抗消化性潰瘍、降壓、抗動脈粥樣硬化等功效，臨床常用于治療呼吸系統、心血管系統、消化系統、腫瘤等疾病[7]。陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，味苦、辛，性溫，歸肺、脾經，具有燥濕化痰、理氣健脾之功效，現代藥理學研究發現其主要有效成分為黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗過敏等作用，廣泛運用于呼吸、心血管、消化等系統疾病[8]。咳嗽為呼吸系統常見疾病，冠心病為心血管常見疾病，中醫理論認為兩者發病均與“痰”相關，半夏、陳皮兩味中藥均為燥濕化痰常用藥，均歸屬于脾、肺兩經，“脾為生痰之源、肺為儲痰之器”，兩者常相須為用，是中醫臨床燥濕化痰之經典藥對，其中化痰名方“二陳湯”是其充分體現，臨床運用該藥對治療兩種疾病均取得較好療效，亦是“異病同治”之法的體現。

本研究通過網絡藥理學這種新型的技術手段，對半夏-陳皮治療咳嗽、冠心病交集靶基因進行GO分析發現，其BP主要集中在炎癥反應、對基因表達的調控、對鈣二醇1-單加氧酶活性的正向調控等方面，CC主要集中在細胞外部分、細胞表面、細胞膜等，MF主要表現在細胞因子活性、蛋白質同源二聚體活性、酶結合等方面。KEGG PATHWAY通路富集分析發現，半夏-陳皮藥對治療冠心病的分子機制主要涉及HIF-1、TNF、AMPK通路等127個通路，治療咳嗽的分子機制則主要涉及NOD樣受體、T細胞受體、Toll樣受體通路等25個通路。藥對“異病同治”的主要信號通路涉及NF-κB通路、NOD樣受體信號通路、TNF通路、TGF-β等30個信號通路。核 轉 錄 因 子-κB（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）通路是參與炎癥反應的“明星通路”，其存在于多種組織中，具有廣泛的生物活性。一般情況下，其以同源或異源二聚體的形式存在于細胞質中，此時其表現為無活性，當其受到一些炎癥介質、病毒、自由基等因素刺激時，無活性的NF-κB進入細胞核中并與其相關的靶基因結合，誘導一些炎癥介質的表達以發揮其生物學效應，研究發現其與動脈粥樣硬化、冠心病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等呼吸、心血管系統疾病相關[9~10]。NOD樣受體（NOD-like Receptors,NLRs）屬天然免疫系統，是哺乳動物先天免疫系統的重要組成部分，其參與細胞內細菌病原體相關分子模式的識別并可引起下游NF-κB信號通路的激活，從而誘發炎癥反應，研究發現其與機體內炎癥反應及代謝障礙相關[11]。腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）是一種涉及系統性炎癥的細胞因子，可誘導多種炎癥介質的釋放，是氣道炎癥的重要介質，其常在咳嗽患者體內表達升高[12]。此外，研究發現冠心病患者體內TNF-α亦過度表達，其作用于冠心病的機制與其促使血管內皮增厚、增加血管內皮平滑肌細胞數量、促使動脈粥樣硬化相關[13]。轉化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）廣泛存在于人體各系統中，TGF-β通路參與細胞生長、分化、凋亡、動態平衡等多種細胞生命活動[14]。其通過促進膠原纖維分泌及沉積、抑制炎癥反應、雙向調節血管平滑肌等多途徑參與冠心病的發生發展，是冠心病發生發展的關鍵信號通路之一[15]。以上這些信號通路均與炎癥反應關系密切，符合半夏-陳皮的藥理學，亦與目前咳嗽、冠心病的機制相符。同時，進一步表明半夏-陳皮“異病同治”咳嗽、冠心病是通過多途徑、多靶點進行治療。