代謝工程改造大腸桿菌生產L-絲氨酸

李旋,王加初,劉益寧,蔣帥,吳鶴云,謝希賢,3*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457) 2(天津科技大學 食品科學與工程學院,天津,300457) 3(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室,天津,300457)

L-絲氨酸(L-serine,L-Ser)可以促進脂肪以及脂肪酸的合成,同時還是半胱氨酸和色氨酸等物質的合成前體,具有重要的生理功能[1],被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等領域。目前L-Ser的生產方法主要包括化學合成法、酶催化法和微生物發酵法,其中微生物發酵法原料來源廣泛,能耗低,對環境友好,是L-Ser生產研究的重點。

生物體中L-Ser合成途徑受到嚴謹的調控,且生成的L-Ser很容易被降解(圖1)。另外,胞內L-Ser積累不僅會抑制細胞分裂和肽聚糖的合成[2],還會轉化為丙烯酸酯等有毒物質對細胞的生長產生抑制[3]。這些因素限制了L-Ser的過量合成。因此,L-Ser高產菌株的構建策略主要包括3個方面：(1)解除反饋調控作用以增強L-Ser合成通量。BELL等[4]通過去除3-磷酸甘油脫氫酶(PGDH,serA基因編碼)的調控域,所得PGDH突變體不受L-Ser反饋抑制,有效促進了L-Ser的合成。(2)阻斷L-Ser降解的途徑。L-Ser可被降解為丙酮酸和甘氨酸,直接阻斷L-Ser向丙酮酸的降解有利于L-Ser的積累,同時不影響細胞正常代謝[5]；但是L-Ser向甘氨酸裂解過程中產生的5,10-亞甲基四氫葉酸對于嘌呤的合成有著關鍵作用,直接阻斷此途徑會對菌體生長產生嚴重的影響。STOLZ等[6]為了弱化L-Ser向甘氨酸的降解,敲除了谷氨酸棒狀桿菌中pabAB和pabC基因,構建了葉酸缺陷性菌株,經過60 h發酵,可積累L-Ser約36 g/L。但是在發酵過程中需添加適量葉酸來調控絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT,glyA基因編碼)的活性,并且生長也受到明顯抑制。(3)提高細胞對L-Ser的耐受性。一是通過適應性進化的方式逐步提升菌株對L-Ser的耐受性,如MUNDHADA等[7]對菌株進行適應性進化,提高了菌株對高濃度L-Ser的耐受性,最終耐受菌經過48 h補料分批發酵,產物積累量為37 g/L,L-Ser產量提高了3倍,對進化菌株進行全基因組測序發現thrA基因突變對減緩L-Ser對細胞毒性有重要的作用。二是選擇合適的轉運蛋白促進胞內L-Ser分泌,從而減緩胞內L-Ser積累對菌體的生長抑制。ZHANG等[8]通過對基因eamA進行同源檢索,發現谷氨酸棒狀桿菌中蛋白SerE可高效轉運L-Ser,菌株經過118 h補料分批發酵,終產量達到50 g/L,這是目前報道的L-絲氨酸的最高產量。

目前,L-Ser菌株構建取得了一定的成效,但是一些關鍵問題如L-Ser向甘氨酸的降解以及菌株對L-Ser的耐受性等還未得到很好的解決。為此本研究以野生型大腸桿菌MG1655為出發菌,通過減弱L-Ser降解途徑,增強L-Ser的合成酶類的表達,以及改造L-Ser的轉運系統,獲得了1株穩定高產,無質粒的非缺陷型大腸桿菌L-Ser生產菌株(圖1)。其中,為了減弱絲氨酸向甘氨酸的降解,采用啟動子Ptrp啟動glyA基因的轉錄表達,通過調整色氨酸的添加時間和添加量對SHMT的活性進行動態調控,有效促進了L-Ser的積累,且未對菌體生長產生明顯影響,可為L-Ser高產菌株的構建提供新的借鑒和參考。

圖1 L-Ser生物合成途徑和本研究的代謝工程改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of L-Ser and the metabolic engineering strategies used in this study

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒以及主要試劑

實驗所用菌株及質粒見表1。Primer STAR HS DNA聚合酶,大連寶生物科技有限公司；2×Rapid Taq Mix、ClonExpress?II One Step Cloning Kit,南京諾唯贊生物科技有限公司；質粒快速提取試劑盒、DNA凝膠純化回收試劑盒,美國Omega公司；引物及基因均由蘇州金唯智科技有限公司合成。

表1 實驗所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 工程菌株構建

根據LI等[9]報道的CRISPR/Cas9基因編輯技術對E.coli基因組進行編輯。操作體系包含pGRB和pREDCas9這2個質粒。其中pREDCas9帶有gRNA質粒的消除系統,λ噬菌體的Red重組系統及Cas9蛋白表達系統,擁有奇霉素抗性,32 ℃培養；pGRB質粒是以pUC18為骨架,質粒含有啟動子J23100,gRNA-Cas9結合區域序列和終止子序列,具有氨芐青霉素抗性,37 ℃培養。通過構建pGRB質粒,使其轉錄相應gRNA,從而與Cas9蛋白形成復合體,通過堿基配對與PAM識別目的基因,實現目的DNA雙鏈斷裂。

1.2.1 重組片段獲得以及重組pGRB質粒構建

根據目的基因的序列,利用軟件Primer Premier 5進行引物設計,通過PCR獲得目的基因片段。以待整合或待敲除位點上下游序列為模板,設計合適的PCR引物,擴增500 bp左右的上、下游同源臂片段。對目的基因片段、上下游同源臂片段進行重疊PCR,以獲得基因整合用的重組DNA片段。進行基因敲除時,只需對上下游同源臂片段進行重疊PCR構建。

使用含有靶序列的DNA雙鏈片段與線性化的載體片段利用同源重組的方法構建pGRB重組質粒。使用CRISPR RGEN Tools網站設計靶序列,設計引物：5-線性化載體末端序列(15 bp)-酶切位點-靶序列(不包括PAM序列)-線性化載體末端序列(15 bp)-3’及其反向互補的引物,單鏈DNA通過退火獲得包括目的序列的DNA雙鏈片段。利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit重組酶將靶序列與線性化的pGRB載體進行重組連接,通過化學轉化的方法導入E.coliDH5α化轉感受態,篩選陽性轉化子,得到含目標靶序列的pGRB載體。

1.2.2 構建重組菌株

將pREDCas9質粒通過電轉化導入感受態細胞中,平板培養并篩選陽性轉化子。將陽性菌株接種到含LB培養基的搖管中培養12 h,再接種于2 XYT培養基(蛋白胨16 g/L,酵母粉10 g/L,NaCl 5 g/L,奇霉素100 mg/L)中培養,待OD600長到0.1～0.2時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,OD600長到0.3～0.4時收集菌體,用10%的甘油洗滌,制備電轉化感受態[10]。將pGRB質粒以及重組片段同時電轉化至感受態細胞中,在含氨芐青霉素抗性和奇霉素抗性的LB平板上,32 ℃培養。待長出單菌落后,通過菌落PCR篩選陽性轉化子,再消除pGRB和pREDCas9質粒,獲得目標菌株。

1.3 L-絲氨酸工程菌株發酵

1.3.1 搖瓶發酵

首先將菌種接種在固體斜面培養基(蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,牛肉膏10 g/L,蔗糖1 g/L,瓊脂粉20 g/L),置于37 ℃培養箱中培養12 h后轉移至新的固體斜面培養基再培養12 h。用接種環刮取一環菌體,接種于裝有30 mL種子培養基的500 mL圓底三角瓶中,用九層紗布封口,37 ℃、200 r/min培養10 h。種子培養基成分為：葡萄糖20 g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨2 g/L,KH2PO4·3H2O 1.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 10 mg/L,MnSO410 mg/L,維生素B11.3 mg/L,維生素B31.3 mg/L,維生素B51.3 mg/L,維生素B71.3 mg/L,維生素B91.3 mg/L,維生素H 1 mg/L,苯酚紅8 mg/L,消泡劑1滴,pH維持在7.0～7.2。將培養好的種子培養液按照10%的接種量接種于30 mL發酵培養基,在37 ℃、200 r/min條件下培養至發酵結束。發酵培養基成分為：葡萄糖20 g/L,KH2PO4·3H2O 2 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,FeSO4·7H2O 20 mg/L,MnSO420 mg/L,維生素B12 mg/L,維生素B32 mg/L,維生素B52 mg/L,維生素B72 mg/L,維生素B92 mg/L,維生素H 2 mg/L,苯酚紅8 mg/L,消泡劑1滴。在發酵過程中,根據培養基中苯酚紅的顏色指示,補加氨水,使發酵液pH值維持在7.0左右。每當葡萄糖耗盡后,補加1 mL 600 mg/mL葡萄糖溶液維持發酵進行,發酵周期為24 h。

1.3.2 發酵罐補料分批發酵

將菌株活化之后使用無菌水沖洗菌體,接種于發酵罐中,發酵罐的種子培養基與搖瓶種子培養基相同。培養過程中通過自動流加質量分數為25%氨水,將pH值穩定在7.0左右,溫度恒定在37 ℃,溶氧在20%～30%。菌體OD600達到10～12時,按照20%的接種量接種至發酵培養基,發酵罐發酵培養基與搖瓶發酵培養基相同。整個發酵過程溶氧維持在20%～30%,pH值維持在7.0,溫度維持在37 ℃,當罐中的葡萄糖耗盡時,通過流加質量濃度800 mg/mL的葡萄糖溶液,維持罐中葡萄糖的質量濃度在0.1～2 g/L內。

1.3.3 發酵過程中的檢測與分析

利用分光光度計測量發酵液在600 nm處的吸光度(OD600),根據已有測試實驗,將菌株OD600值乘以0.39換算為細胞干重(dry cell weight,DCW)值。發酵液中的殘糖量使用生物傳感器進行檢測。采用Sykam S433D氨基酸分析儀檢測發酵液中L-Ser濃度[11],具體檢測按照廠商提供的標準操作流程進行。

1.3.4 發酵數據統計學分析

發酵數據代表3組平行發酵數據的平均值和標準偏差。利用t檢驗雙尾分布對改造菌和對應出發菌的發酵結果進行單向方差分析。0.01

2 結果與分析

2.1 阻斷L-Ser向丙酮酸的降解途徑

大腸桿菌中L-Ser可由sdaA,sdaB以及tdcG基因編碼的絲氨酸脫氨酶降解為丙酮酸,也可由絲氨酸羥甲基轉移酶(SHMT,由glyA基因編碼)降解為甘氨酸[12-13]。本研究先將野生型大腸桿菌MG1655中編碼絲氨酸脫氨酶的3個基因sdaA,sdaB以及tdcG進行敲除,阻斷L-Ser向丙酮酸的降解,獲得菌株SER01。搖瓶發酵結果顯示(圖2),發酵結束后,兩株菌的細胞干重沒有明顯的差異,而3個基因敲除后,SER01可積累0.12 g/L的L-Ser,是出發菌株的2.77倍,說明阻斷L-Ser向丙酮酸降解有效促進了L-Ser的積累,且對菌體的生長無影響。

圖2 阻斷L-Ser向丙酮酸的降解對L-Ser發酵的影響Fig.2 Effect of blocking the degradation of L-Ser to pyruvate on L-Ser fermentation

2.2 強化L-Ser的合成酶類的表達

增加產物合成相關酶類的表達是構建工程菌種的常見策略。胞內3-磷酸甘油酸依次被磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH,由serA基因編碼),磷酸絲氨酸轉氨酶(PAST,由serC基因編碼)以及磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP,由serB基因編碼)催化生成L-Ser[14]。其中PGDH為L-Ser合成限速關鍵酶,其活性受到L-Ser的反饋抑制。根據文獻報道[15],將PGDH中的第344位的組氨酸以及第364位的天冬酰胺替換為丙氨酸,可解除終產物對關鍵酶的反饋抑制。因此,本研究將該突變體的編碼基因serA*整合到假基因位點yjiP,并由強啟動子Ptrc啟動轉錄,獲得菌株SER02。搖瓶發酵結果顯示,SER02的L-Ser產量為1.23 g/L,相比SER01提高了9.25倍；細胞干重為8.69 g/L,相比SER01降低了30.14%。結果說明serA*強化表達能增強L-Ser合成代謝,但對細胞生長存在一定程度的抑制作用。接著在SER02的假基因yjiV和ycjV位點分別整合了serC,serB基因,并由強啟動子Ptrc啟動轉錄,獲得菌株SER03。搖瓶驗證結果顯示(圖3),SER03的L-Ser產量達到5.41 g/L,是菌株SER02的4.39倍。

圖3 強化L-Ser合成酶的表達對L-Ser發酵的影響Fig.3 Effect of enhancing the expression of L-Ser synthases on L-Ser fermentation

結果說明serC,serB基因表達的強化,顯著增強了L-Ser的合成途徑,有效促進了L-Ser的積累。另外,相比于對SER02,SER03的細胞干重有所增加,說明serC,serB基因表達使L-Ser的合成途徑更為通暢,一定程度上緩解了關鍵基因serA*的單獨表達所造成的代謝不平衡。為了進一步加強L-Ser的合成途徑,本研究在假基因rph位點對serA*進行雙拷貝,由強啟動子Ptrc啟動轉錄,獲得菌株SER04。搖瓶驗證結果顯示(圖3),SER04的L-Ser產量和細胞干重都大幅降低,說明serA*基因轉錄表達的強度過大,會使胞內代謝嚴重失衡,不利于菌體生長和產酸。

2.3 L-Ser轉運系統的改造

轉運系統對氨基酸生產有重要影響,促進產物外排,減弱或阻斷產物吸收途徑是提高產物合成效率的重要舉措[16]。高濃度L-Ser會對細胞產生生理毒性,及時將其從胞內轉出有利于細胞正常生長。L-Ser與半胱氨酸結構相似,半胱氨酸轉運蛋白EamA也可向胞外轉運L-Ser[17]。本研究在菌株SER03的假基因tehB位點上,整合了eamA基因,由強啟動子Ptrc啟動轉錄,獲得菌株SER05。搖瓶驗證結果顯示(圖4),SER05的L-Ser產量達到7.41 g/L,較SER03提高了36.96%,說明強化轉運蛋白EamA的表達,促進了L-Ser向胞外轉運,有效促進了L-Ser的合成。另外,SstT和SdaC也是L-Ser的轉運蛋白[18-19],可從胞外攝取L-Ser。于是本研究依次敲除了菌株SER05的sstT和sdaC基因,構建了菌株SER06和SER07。搖瓶驗證結果顯示(圖4),SER06的L-Ser產量為8.65 g/L,相較于SER05提高了16.73%,SER07的L-Ser產量為11.23 g/L,相較于SER05提高了51.32%。結果表明sstT和sdaC基因的敲除顯著促進了胞外L-Ser積累。

圖4 轉運系統改造對L-Ser發酵的影響Fig.4 The effect of transport system modifications on L-Ser fermentation

2.4 SHMT表達的調控

L-Ser可由SHMT降解為甘氨酸,制約著L-Ser的大量積累。為了阻斷該降解途徑,促進L-Ser的合成,本研究首先嘗試將SER07的glyA基因敲除,構建了菌株SER08。搖瓶發酵結果顯示(圖5-a),敲除glyA基因后菌體的生長和產酸都顯著下降。這是因為L-Ser裂解為甘氨酸的反應是一碳循環的重要一環[20],對細胞代謝意義重大。因此選擇合適的方式調控SHMT表達,平衡細胞生長與產物積累之間的關系,才會有效促進L-Ser的積累。

目前通過調節glyA基因表達來增加L-Ser積累已有較多報道,包括構建葉酸缺陷型[6]或者甘氨酸缺陷型[20]等方法,但是所得菌株在發酵過程中即便補加了適量的葉酸或者甘氨酸,菌體生長還是會受到一定的抑制,導致這些方法對L-Ser產量提升的效果有限。大腸桿菌色氨酸的合成受到嚴謹的多重調控,在轉錄水平上,色氨酸操縱子基因的轉錄會受到轉錄弱化和轉錄阻遏兩種機制的調控。這兩種調控機制都和色氨酸操縱子的啟動子Ptrp相關,而Ptrp的強度受胞內色氨酸濃度的負調控[21]。為此本研究將glyA基因自身啟動子替換為Ptrp,使glyA基因在菌株生長前期可以表達,保證細胞正常生長,待發酵至一定階段后,通過向培養基中添加色氨酸弱化甚至阻斷glyA基因的轉錄表達,減少L-Ser向甘氨酸的代謝,以期增加L-Ser積累。

將菌株SER08的glyA基因整合到假基因位點yeep上,用Ptrp啟動子啟動轉錄,獲得菌株SER09。發酵結果顯示(圖5-a),菌株SER09的L-Ser產量為12.23 g/L,比SER07(原啟動子控制glyA基因)提高了8.28%,DCW為8.93 g/L,比SER07降低了15.43%。因此總體來看,SER09的單位菌體產酸相比SER07提高了50%。更為明顯的效果是,SER09的總耗糖為54.54 g/L,比SER07(109.0 g/L)降低了49.96%,因此糖酸轉化率提高了1.15倍。隨后本研究通過色氨酸的添加進一步調控SHMT的表達。首先在0,4,8,12,16 h分別添加200 mg/L色氨酸,以不添加色氨酸作為對照組,考察了色氨酸添加時間對L-Ser發酵的影響,結果顯示(圖5-b),發酵液中L-Ser積累量隨著色氨酸添加時間的延長而增加,在發酵12 h時添加色氨酸效果最好。過早添加色氨酸可能會導致SHMT活性太弱,嚴重影響菌體生長,導致L-Ser產量也相應降低；過晚添加色氨酸則無法有效調控SHMT的表達,于是最終選擇在發酵12 h時添加色氨酸。接著對色氨酸的添加量進行測試,結果顯示(圖5-c),培養基中添加50 mg/L色氨酸即可滿足實驗需求。最終在12 h添加50 mg/L色氨酸,SER09的L-Ser產量達到13.53 g/L,相比SER07,糖酸轉化率提高了140%,單位菌體產酸提高了50%(表2)。

a-SHMT不同調控方式對L-Ser發酵的影響；b-不同色氨酸添加時間對L-Ser發酵的影響；c-不同色氨酸添加量對L-Ser發酵的影響圖5 啟動子Ptrp調控SHMT表達對L-Ser發酵的影響Fig.5 The effect of SHMT expression regulated by Ptrp promoter on L-Ser fermentation.

表2 啟動子Ptrp調控SHMT表達對L-Ser發酵的影響Table 2 The effect of SHMT expression regulated by Ptrp promoter on L-Ser fermentation

2.5 工程菌發酵罐發酵測試

為測試菌株的綜合性能,將菌株SER07和SER09進行5 L發酵罐發酵測試,在發酵12 h時添加50 mg/L色氨酸。發酵結果顯示,SER09雖然菌體生長速度變慢,但是最終的DCW值和SER07差距不大,并且在發酵前期SER09產酸速率明顯高于SER07,28 h時SER09產酸達到最高值為22.31 g/L,SER07在32 h時產量達到最高值22.07 g/L(圖6)。28 h時SER09的糖酸轉化率為0.19 g/(g葡萄糖),比菌株SER07(32 h)提高84.38%,發酵結束時SER09的單位菌體產酸為1.25 g/g DCW,比菌株SER07提高了25.19%。本研究利用Ptrp啟動子啟動glyA基因的轉錄表達,通過控制色氨酸的添加量和添加時間動態調控SHMT的表達,結果表明這種調控方式不會造成營養缺陷,可在滿足菌體正常生長的前提下,有效降低SHMT的活性,顯著增強了L-Ser的合成途徑。另外,SER07和SER09在發酵后期L-Ser濃度達到20 g/L左右以后,L-Ser產量都不再增加,這可能跟胞內高濃度L-Ser會對細胞產生生理毒性有關。增強菌株對高濃度L-Ser的耐受性是后續菌種性能優化的重點。適應性進化可有效提高菌株的耐受性,其近年也被成功地應用于激活細胞潛在通路或者提高目標產物的產量[22]。YONGZE等[23]通過進化提高大腸桿菌KC01對乙醇耐受性,使所得突變體SZ407與對照菌株相比,細胞干重提高了67%,單位體積乙醇生產速率提高48%,最終產量提高94%,改造效果明顯。適應性進化的方法也用提高菌株對高濃度L-Ser耐受的菌株[7]。因此為提高工程菌株SER09L-Ser的產量,可對其進行傳代培養,在培養過程中逐步增加培養基中L-Ser的添加量,獲得高耐L-Ser的菌株。

圖6 工程菌SER07和SER09在5 L發酵罐上分批 補料發酵結果Fig.6 Fed-batch fermentation results of the engineered strain SER07 and SER09 in a 5 L bioreactor.

3 結論

本研究對野生型大腸桿菌MG1655進行了系統的代謝工程改造,從頭構建了1株L-Ser生產菌。主要是在基因組水平上,阻斷了L-Ser向丙酮酸降解,增強了L-Ser合成酶類的表達并對L-Ser轉運系統進行了改造。為進一步促進L-Ser的積累,本研究重點對SHMT的表達進行了調控：利用啟動子Ptrp啟動glyA基因的表達,在發酵12 h,菌體生長到一定程度后,通過外源添加50 mg/L的色氨酸,弱化glyA基因的轉錄表達。這種調控方式有效抑制了SHMT的活性,且未對菌體生長造成明顯影響,因而顯著提高了L-Ser的合成效率。工程菌株SER09是1株不含質粒,遺傳背景清晰,無缺陷型的L-Ser生產菌株。最終所得工程菌株SER09在5 L罐上發酵28 h,可生產22.31 g/L的L-Ser,其糖酸轉化率以及單位菌體產酸相較對照菌株SER07分別提高84.38%以及25.19%,且培養過程中無需額外添加甘氨酸,改造效果明顯,適合作為平臺菌株用于進一步的性能改良,具有較好的應用前景。另外,胞內高濃度L-Ser會對細胞產生生理毒性,這可能是發酵中后期L-Ser的質量濃度達到20 g/L左后停止增長的原因,因此在后期研究中計劃利用適應性進化方法增強細胞的耐受性,利用高濃度L-Ser作為選擇壓力對工程菌株SER09進行傳代培養,篩選具有一定耐受性的菌株,進一步提升菌株L-Ser的發酵性能。