基于混菌耦合發酵策略合成3′-唾液酸乳糖

游星,郭進,張洪濤*,閆競宇,CHAI Wengang ,周文,劉栗彤,黎玉, 吳劍榮,詹曉北*

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(中國科學院大連物理化學研究所,遼寧 大連,116021) 3(Glycoscience Laboratory,Imperial College London,South Kensington Campus,UK London,SW7 2AZ)

母乳寡糖作為在人乳中含量僅次于乳糖和脂類的第三大固體成分[1],對嬰幼兒的健康發育具有重要作用。其主要由2種結構組成：一種由中性寡糖組成,其中許多是巖藻糖基化的;另一種則含有酸性寡糖,其中大多數是唾液酸化的[2]。唾液酸化寡糖中最豐富的結構是唾液酸與乳糖結合產生的唾液酸乳糖[3],根據結合位置不同分為3′-唾液酸乳糖(3′-sialyllactose,3′-SL)和6′-唾液酸乳糖[4]。3′-SL具有抗菌和抗炎活性,可以使嬰兒腸道免受感染,有助于嬰兒免疫系統的發育和成熟,促進嬰兒大腦成熟,改善學習能力等作用[5-8],近年來受到人們越來越多的關注。

合成唾液酸乳糖的方法主要有化學合成法和生物合成法,由于化學合成法涉及到繁瑣的保護和去保護步驟,不適合大規模生產,所以利用生物技術合成唾液酸乳糖成為最佳方案[9]。唾液酸乳糖的合成需要將唾液酸活化為胞苷單磷酸-N-乙酰神經氨酸(cytidine 5′-monophosphateN-acetylneuraminic acid,CMP-Neu5Ac)[10],該過程是一個需要消耗大量三磷酸胞苷(cytidine triphosphate,CTP)的過程。由于CTP價格昂貴(8 000元/kg),造成作為唾液酸乳糖前體物質的CMP-Neu5Ac不僅價格昂貴,并且不容易大量獲得,限制了唾液酸乳糖的產量。針對以上缺陷,ENDO等[11]建立了以3株重組大腸桿菌和產氨棒桿菌耦合合成唾液酸乳糖的系統。該策略通過產氨棒桿菌實現CMP到CTP的再生,降低了CTP的使用。但是由于其需要尿苷三磷酸(uridine triphosphate,UTP)來實現CTP的再生,在發酵體系中不得不引入專門合成UTP的菌株,使得該體系不僅發酵控制復雜,而且生產成本高的問題依然存在[12-13]。因此,如何簡化發酵催化體系組成與工藝成為亟需解決的問題。

研究發現酵母利用自身的酶系能有效地將CMP催化合成CTP[14]。啤酒酵母具有來源廣、培養方便、價格低廉等特點,還有不能利用乳糖發酵的特征,這樣以乳糖作為底物時就不會被酵母細胞所代謝消耗。因此,研究團隊提出了3菌耦合發酵合成3′-SL的方案(見圖1)：

圖1 設計的全細胞催化合成唾液酸乳糖路線Fig.1 Designed strategy for sialyllactose synthesis

(1)利用廢啤酒酵母實現CTP的循環再生。

(2)用含有CMP-Neu5Ac合成酶基因(neuA)的工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA實現以CTP和N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac,也叫唾液酸)為底物合成CMP-Neu5Ac。

(3)用含有唾液酸轉移酶基因(nst)的工程菌JM109(DE3)/pET28a-nst來實現唾液酸轉移酶的表達。

(4)通過基因工程菌株JM109(DE3)/pET28a-neuA、JM109(DE3)/pET28a-nst和啤酒酵母混菌培養耦合發酵,實現3′-SL的合成。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

廢啤酒酵母由江南大學生物工程學院啤酒吧平臺饋贈；實驗所需基因來源于腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)；EscherichiacoliJM109(DE3),天根生化科技(北京)有限公司；表達載體pET28a為本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器

質粒提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性內切酶、Taq酶、T4DNA連接酶,寶生物工程(大連)有限公司；CMP、CTP(800元/100 g),杭州鎧朋生物技術有限公司；Neu5Ac,本實驗室合成；CMP-Neu5Ac,西安齊岳生物科技有限公司；3′-SL,大連化物所閆競宇博士提供；其他為國產分析純試劑。

PCR儀、蛋白電泳儀,Bio-Rad公司；高效液相色譜儀,島津公司；高速冷凍離心機,Sigma公司。

1.1.3 培養基及培養條件

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10,NaCl 10,酵母提取物5,pH 7.0,121 ℃滅菌20 min。

巧克力色瓊脂平板(g/L)：蛋白胨10,牛肉浸膏3,NaCl 5,瓊脂20,脫纖維羊血50 mL,pH 7.2。

培養條件：將腦膜炎菌株接種到巧克力瓊脂平板上,37 ℃、5%CO2環境培養24 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA的構建

1.2.2 工程菌JM109(DE3)/pET28a-nst的構建

1.2.3 重組蛋白的表達與鑒定

將工程菌株接種至含20 μg/mL Kan的10 mL LB液體培養基中,37 ℃、200 r/min搖瓶培養12 h,再按2%(體積分數)的接種量轉接到含20 μg/mL Kan的100 mL LB液體培養基中,37 ℃、200 r/min搖瓶培養至OD600約為0.6后,加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行誘導,200 r/min搖瓶培養20 h。4 ℃、8 000×g離心10 min收集菌體。將誘導前及誘導20 h的菌液與SDS-PAGE Loading緩沖液混勻,100 ℃加熱10 min,得到誘導前、后樣品,SDS-PAGE檢測蛋白表達。

1.2.4 唾液酸乳糖及其中間產物的合成

1.2.4.1 CMP-Neu5Ac的生成

工程菌株合成CMP-Neu5Ac的轉化條件：10 mL體系中包含60 mmol/L CTP、20 mmol/L MgCl2、60 mmol/L Neu5Ac、1 mmol/L DTT、150 mmol/L Tris、50 g/L JM109(DE3)/pET28a-neuA,在30 ℃、200 r/min的條件下反應4 h[15]。

雙菌耦合催化合成CMP-Neu5Ac的轉化條件：以70 mmol/L CMP、60 mmol/L Neu5Ac為底物,在300 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L MgCl2、248.3 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L DTT、150 mmol/L Tris、10 mL/L甘油、6 mL/L乙醛、100 g/L啤酒酵母、50 g/L JM109(DE3)/pET28a-neuA的溶液中,反應4 h(30 ℃,200 r/min)。

1.2.4.2 唾液酸乳糖的生成

單細胞合成3′-SL的轉化條件：2 mL體系中包含1 mL按照1.2.4.1中方法合成的CMP-Neu5Ac溶液和1 mL 80 mmol/L乳糖、20 mL/L甘油、10 mL/L二甲苯、248.3 mmol/L KH2PO4、5 g/L MgCl2、4 g/L Nymeen S-215、50 g/L JM109(DE3)/pET28a-nst組成的溶液,30 ℃、200 r/min反應30 h[11]。

雙菌耦合合成3′-SL的轉化條件：以60 mmol/L CTP、60 mmol/L Neu5Ac、80 mmol/L乳糖為底物,在20 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT、150 mmol/L Tris、20 mL/L甘油、10 mL/L二甲苯、4 g/L Nymeen S-215、248.3 mmol/L KH2PO4、50 g/L JM109(DE3)/pET28a-neuA、50 g/L JM109(DE3)/pET28a-nst溶液中,30 ℃、200 r/min的條件下反應30 h。

3菌耦合合成3′-SL的轉化條件：以70 mmol/L CMP、60 mmol/L Neu5Ac、80 mmol/L乳糖為底物,在含300 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L MgCl2、248.3 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L DTT、150 mmol/L Tris、20 mL/L甘油、6 mL/L乙醛,10 mL/L二甲苯、4 g/L Nymeen S-215、100 g/L啤酒酵母、50 g/L JM109(DE3)/pET28a-neuA、50 g/L JM109(DE3)/pET28a-nst溶液中,30 ℃、200 r/min的條件下反應30 h。

1.2.5 唾液酸乳糖與CMP-Neu5Ac的分析檢測

1.2.5.1 CMP-Neu5Ac的分析檢測

TLC檢測：參考HIGA等[16]方法略有改動。展開劑∶V(乙醇)∶V(1 mol/L pH 6.5乙酸銨)=6∶4,通過紫外線照射顯色。

HPLC檢測：色譜條件為依立特C185 μm(4.6 mm×250 mm)；流動相A為0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液和8 mmol/L四丁基硫酸氫銨(pH 5.3),流動相B為70%流動相A與30%(體積分數)甲醇；梯度洗脫程序(A變化)：0～2.5 min 100%,2.5～10 min 100%～60%,10～11 min 60%～0%,11～15 min保持0%,15～16 min 0%～100%,16～30 min保持100%；0.6 mL/min；進樣量為10 μL；紫外檢測波長270 nm；柱溫30 ℃[17]。

1.2.5.2 唾液酸乳糖的TLC檢測及分離純化

TLC檢測：展開劑：V(正丙醇)∶V(水)∶V(25%氨水)=7.5∶3∶2[18]；顯色劑：苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑,4 g二苯胺、4 mL苯胺與20 mL 85%(體積分數)磷酸共溶于200 mL丙酮中[19]；105 ℃加熱5 min顯色。

分離純化方法：HyperSep Hypercarb固相萃取小柱(SPE小柱),先用3 mL甲醇活化,再用3 mL水平衡,上樣500 μL,流出的液體記為“流穿”,接著用3 mL水洗,得到的溶液記為“水洗”,最后用3 mL 80%(體積分數)乙腈洗脫,得到的溶液記為“純化后”。

2 結果與分析

2.1 工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA的構建及NeuA誘導表達

以N.meningitidis基因組為模板,通過PCR獲得大小為687 bp的neuA基因,然后將該基因引入pET28a載體,獲得質粒pET28a-neuA。重組質粒pET28a-neuA經過NdeI和SalI雙酶切后,結果如圖2-a所示,得到兩條片段分別大約為5 300 bp和700 bp。經測序驗證正確后,得到重組質粒pET28a-neuA。

將重組質粒pET28a-neuA轉入JM109(DE3)得到工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA,用IPTG誘導目的蛋白表達,SDS-PAGE電泳結果如圖2-b所示,從圖中可以看出,誘導20 h的全細胞在25～35 kDa有明顯的表達條帶,其分子質量與KARWASKI等[15]報道的CMP-Neu5Ac合成酶(NeuA)一致,說明NeuA在工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA中成功表達。

a-重組質粒pET28a-neuA雙酶切圖； b-重組質粒pET28a-neuA SDS-PAGE圖a:M-10 000 DNA Marker；1-Nde I/Sal I雙酶切 b:M-Protein Marker；1-誘導前全細胞；2-誘導20 h的全細胞圖2 重組質粒pET28a-neuA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of recombinant plasmid pET28a-neuA

2.2 工程菌JM109(DE3)/pET28a-nst的構建及Nst的誘導表達

以N.meningitidis基因組為模板,通過PCR獲得大小為1 137 bp的nst基因,然后將該基因引入pET-28a載體,獲得重組質粒pET28a-nst。對重組質粒pET28a-nst進行了NcoI和BamH I雙酶切驗證,電泳結果如圖3-a所示,得到2條片段分別大約為5 300和1 100 bp。經測序驗證正確后,得到重組質粒pET28a-nst。

然后將重組質粒pET28a-nst轉入JM109(DE3)得到工程菌JM109(DE3)/pET28a-nst。用IPTG誘導唾液酸轉移酶(Nst)的表達,其SDS-PAGE電泳結果如圖3-b所示,誘導20 h的全細胞與誘導前相比,其在35 k～45 kDa有明顯的表達條帶,與目標蛋白(43.3 kDa)一致。這表明Nst在工程菌JM109(DE3)/pET28a-nst中成功表達。

a-重組質粒pET28a-nst雙酶切圖； b-重組質粒pET28a-nst SDS-PAGE圖a:M-10 000 DNA Marker；1-Nco I/BamH I雙酶切 b:M-Protein Marker；1-誘導前全細胞；2-誘導20 h的全細胞圖3 重組質粒pET28a-nst電泳圖Fig.3 Electrophoresis of recombinant plasmid pET28a-nst

2.3 CMP-Neu5Ac耦合發酵合成體系優化

2.3.1 工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA合成CMP-Neu5Ac的條件優化

為順利實現雙菌(啤酒酵母和工程菌株JM109(DE3)/pET28a-neuA)耦合發酵高效合成CMP-Neu5Ac,對耦合發酵的條件進行了優化。首先用單一工程菌株JM109(DE3)/pET28a-neuA,從其誘導溫度、工程菌株濃度、底物CTP和Neu5Ac濃度和工程菌株的循環利用次數,進行了單因素催化條件優化,結果如圖4所示。

a-誘導溫度；b-菌體濃度；c-底物CTP和Neu5Ac濃度；d-細胞重復使用次數圖4 不同因素對JM109(DE3)/pET28a-neuA合成CMP-Neu5Ac的影響Fig.4 The influence of different factors on the synthesis of CMP-Neu5Ac by JM109(DE3)/pET28a-neuA

由圖4-a可知,當細胞的誘導溫度是37 ℃時,CMP-Neu5Ac產量高于16和30 ℃時的產量,因此,選取37 ℃為最佳誘導溫度。

然后,以此優化的催化發酵體系為基礎,探索菌體濃度對CMP-Neu5Ac合成的影響,結果如圖4-b所示。菌株質量濃度為200和250 g/L時,其CMP-Neu5Ac在1 h時即達到最大值,隨著催化時間的增加,CMP-Neu5Ac被逐漸降解；當菌株質量濃度為100和150 g/L時,其CMP-Neu5Ac的合成在2 h時達到最大數值,尤其是后者生成的CMP-Neu5Ac濃度最高,高達25.9 g/L,然后隨著時間的增加,CMP-Neu5Ac迅速降解；當菌株質量濃度為50 g/L時,其CMP-Neu5Ac的合成先隨著時間的增加而增加,反應4 h時CMP-Neu5Ac達到最大值,為23.3 g/L,轉化率為63.2%,然后隨著時間的增加,合成的CMP-Neu5Ac濃度基本保持穩定,維持在22 g/L?？紤]到穩定的CMP-Neu5Ac體系更有利于后續唾液酸乳糖合成,因此,選擇50 g/L JM109(DE3)/pET28a-neuA作為最優菌株濃度。

在確定最優誘導溫度和最優細胞濃度的基礎上,又進一步研究了底物CTP和Neu5Ac濃度對CMP-Neu5Ac合成的影響,結果見圖4-c。在CTP和Neu5Ac濃度低于60 mmol/L時,CMP-Neu5Ac的產量逐漸上升,在60 mmol/L達到最高,但是隨著底物濃度的增加,CMP-Neu5Ac的產量逐漸下降,故選取CTP和Neu5Ac濃度為60 mmol/L為最優濃度。

工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA是否具有重復使用性是工業應用中考慮的重要因素之一,對選擇分批發酵還是流加補料發酵策略具有重要指導意義。因此,按照此前優化的條件,研究了工程菌株重復利用對CMP-Neu5Ac的影響,結果如圖4-d所示,以第1次的轉化率設定為100%計算,經過5次重復使用后,工程菌株的CMP-Neu5Ac轉化率仍為第1次的47%。因此,工程菌株JM109(DE3)/pET28a-neuA既可以用于補料發酵,也可以用于分批發酵。

2.3.2 酵母和工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA耦合發酵合成CMP-Neu5Ac

為降低合成CMP-Neu5Ac的成本,進行了以CMP和Neu5Ac為底物,通過啤酒酵母和JM109(DE3)/pET28a-neuA耦合發酵來合成CMP-Neu5Ac。由圖5-a可知,經耦合催化系統催化后,成功在發酵液中檢測到CMP-Neu5Ac。

a-TLC圖；b-標品CMP液相圖；c-標品CMP-Neu5Ac液相圖； d-雙菌耦合催化產物液相圖 a：1-CMP；2-CDP；3-CTP；4-CMP-Neu5Ac；5-雙菌耦合催化產物圖5 CMP-Neu5Ac的檢測Fig.5 Determination of CMP-Neu5Ac

為進一步確定產物,采用HPLC對CMP、CMP-Neu5Ac標品和啤酒酵母與JM109(DE3)/pET28a-neuA耦合催化產物進行了分析,雙菌耦合催化產物的出峰時間與標準CMP-Neu5Ac相同(圖5-c和圖5-d),并且發酵液中CMP-Neu5Ac濃度為11.9 g/L。

2.4 唾液酸乳糖的耦合發酵合成體系建立

為實現“3菌株耦合發酵”策略的唾液酸乳糖合成,采用“單菌合成唾液酸乳糖—雙菌耦合發酵合成唾液酸乳糖—3菌耦合發酵合成3′-SL”的遞進思路來進行。

利用JM109(DE3)/pET28a-nst全細胞催化合成3′-SL,催化反應結束后,用SPE小柱純化,TLC分析純化前和純化后樣品,結果如圖6所示。

1-乳糖；2-3′-SL；3-純化前；4-純化后圖6 TLC檢測單菌催化產物Fig.6 Detection of the product producing from engineered bacteria fermentation with TLC

從圖6可以看出,發酵液中乳糖并沒有被利用完全,純化后組分(L4)與標準品3′-SL的比移值(retention factor value,Rf)相同。因此,單細胞存在的條件下,以CMP-Neu5Ac和乳糖為底物,可以合成3′-SL。

接著,進行了JM109(DE3)/pET28a-neuA和JM109(DE3)/pET28a-nst雙菌耦合發酵合成3′-SL的探索工作。雙菌催化結束后,上清液用SPE小柱純化,進行TLC檢測,結果如圖7所示。L3有與標準品3′-SLRf相同的寡糖存在,發酵液用SPE柱純化后的不同組分依次為L4、L5和L6,其中L6的Rf值與標準品3′-SL完全相同,但同時有乳糖的存在,這是因為80%(體積分數)乙腈不僅能洗脫酸性寡糖,還能把中性寡糖洗脫下來,與PACKER等[20]研究結果一致。這表明以CTP、唾液酸和乳糖為底物,通過雙菌耦合發酵成功合成了3′-SL。

1-乳糖；2-3′-SL；3-純化前；4-流穿；5-水洗； 6-純化后；7-對照(CMP-Neu5Ac和乳糖混合)圖7 TLC檢測雙菌耦合催化產物Fig.7 Detection of the product producing from two strains coupling fermentation with TLC

為建立“3菌株耦合發酵”體系,合成3′-SL,在雙菌株耦合發酵成功合成3′-SL體系基礎上,添加了啤酒酵母,進行3菌混合發酵,而底物則用廉價的CMP替代價格昂貴的CTP。經過30 h的發酵后,用TLC分析檢測,結果如圖8所示,發酵液(L3)中含有與標準品3′-SL相同Rf值的組份,這表明利用“3菌株耦合發酵體系”成功實現了3′-SL的合成。但是同時發酵液中殘留大量的乳糖,3′-SL轉化率不高,如何解決3′-SL轉化率不高問題成為下一步需要解決的問題。

1-乳糖；2-3′-SL；3-三菌耦合催化產物圖8 3菌耦合催化產物的TLC分析圖Fig.8 Detection of the product producing from three strains coupling fermentation with TLC

3 討論

本文通過廢啤酒酵母與JM109(DE3)/pET28a-neuA耦合發酵,實現了以CMP和Neu5Ac為底物,高效合成CMP-Neu5Ac的目的,在CTP充足的條件下,JM109(DE3)/pET28a-neuA經過5個批次的分批發酵,其轉化率仍可達到第1次使用時的47%,唾液酸乳糖合成中,最為關鍵的是CMP-Neu5Ac的供給問題,本研究以啤酒酵母和JM109(DE3)/pET28a-neuA耦合,實現了CMP-Neu5Ac的高效再生和供給,尤其是JM109(DE3)/pET28a-neuA可重復使用特性對低成本合成CMP-Neu5Ac具有重要意義。

本研究利用“3菌耦合發酵體系”成功實現了3′-SL的合成。以往合成唾液酸乳糖主要采用酶法和單細胞法。酶法合成由于存在著酶提取純化工藝,增加了生產成本；而單細胞合成由于存在代謝負擔和代謝壓力,新的合成途徑的引入可能會打破宿主原有的物質能量代謝平衡等問題,產量相對較低。本研究針對自然界的共生互利現象,建立了耦合發酵體系,實現了唾液酸乳糖的合成,為唾液酸乳糖的大規模、廉價合成提供了可能。