適應性馴化生產低分子質量β-葡聚糖及其抗氧化活性研究

王冰,朱莉,李茂瑋,詹曉北*

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(無錫格萊克斯生物科技有限公司,江蘇 無錫,214125)

β-葡聚糖是葡萄糖以β-糖苷鍵連接而成的同型多糖,具有降低膽固醇、調節血糖血脂、調節腸胃健康等功效[1-2]。β-葡聚糖的水解產物β-葡寡糖,是一種不可消化的低聚糖,可在不同程度上被腸道微生物菌群發酵[3],具有促進乳酸菌生長和免疫調節等的作用[4-5]。近年來,β-葡聚糖成為研究熱點,但發酵條件、來源等因素影響著β-葡聚糖的溶解性、相對分子質量及功能特性。

熱凝膠是一種由土壤桿菌在氮源匱乏條件下合成的僅由β-D-1,3-糖苷鍵連接而成的線性葡聚糖,在韓國、中國臺灣地區和日本已被注冊為膳食纖維[6]。但是熱凝膠的水不溶性限制了其生物活性的發揮,一些研究表明,熱凝膠經過降解得到的β-1,3-葡聚糖,是一種可被水溶解且有較好生理功能的低聚糖[7],在醫學保健、生物、日化等領域具有很高的應用價值[8-10]。YANG等[11]研究表明,β-葡聚糖通過不同傳達方式被吞噬細胞輸送或釋放,從而產生各種生理活性。但目前利用不同降解方法得到的低分子質量葡聚糖依然存在著轉化率低、耗能大、污染大、分子質量分布不均等問題[12-14]。如果可以用微生物直接發酵得到低分子質量β-1,3-葡聚糖,將會進一步擴大葡聚糖的應用領域。

甘油是被廣泛認可并使用的工業原料[15]。土壤桿菌ATCC 31749 可以將甘油等醇類化合物作為碳源,本研究利用甘油做為碳源對土壤桿菌進行馴化挑選,引導菌株生產低分子質量β-葡聚糖,在廢物利用的同時提高土壤桿菌合成低分子質量β-葡聚糖的活力,并對其產物結構、抗氧化活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

Agrobacteriumsp.ATCC 31749、Agrobacteriumsp.WS-8E3T(由甘油梯度適應性馴化篩選獲得),均保藏于糖化學與生物技術教育部重點實驗室。

1.1.2 培養基

平板培養基 (g/L)：甘油100.0,酵母粉10.0,蛋白胨2.0,魚粉蛋白胨2.0,瓊脂粉 20.0,pH 7.0,121 ℃ 滅菌鍋滅菌20 min。

基礎鑒別培養基：酵母粉10.0 g/L,剛果紅溶液(10 mg/mL 剛果紅水溶液)0.5%(體積分數),瓊脂粉 20.0 g/L,pH 7.0,115 ℃ 滅菌20 min。

種子培養基 (g/L)：甘油 40.0,酵母粉 6.0,MgSO40.5,KH2PO41.5,pH 7.0,115 ℃滅菌30 min。

搖瓶發酵培養基 (g/L)：甘油 100.0,酵母粉 6.0,KH2PO43.0,MgSO41.5,(NH4)2S043.0,pH 7.0,121 ℃ 滅菌20 min。

基礎馴化培養基為種子培養基。馴化過程中培養基中甘油質量濃度以10 g/L為梯度增加至100 g/L,其他成分不變。

1.1.3 主要儀器

LC-2010A高效液相色譜儀,Waters；ICS5000離子色譜儀,美國Dionex公司；Thermo Nicolet NEXUS型傅里葉紅外光譜儀,美國尼高力公司；Avance Ⅲ型NMR光譜儀,德國Bruker公司。

1.1.4 主要試劑

木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸及半乳糖、剛果紅、高碘酸鉀、甘露糖、抗壞血酸,分析純,Sigma-Aldrich；Dextran 右旋糖苷標準品,色譜純,美國聚合物標準品公司；蛋白濃度測量試劑盒,碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純,國藥集團(上海)。

1.2 土壤桿菌適應性馴化選育過程

將Agrobacteriumsp.ATCC 31749在種子培養基中培養16 h后,按10%體積分數的接種量接入含50 g/L甘油的馴化培養基中,于30 ℃、200 r/min 培養 16 h,然后按同樣方法連續傳代10次,取 0.1 mL 發酵液稀釋涂布到含有 50 g/L 甘油的鑒別培養基上,于30 ℃培養36 h,挑取菌落形態圓潤凸起、表觀透明、顏色深紅的單菌落接種到含60 g/L 馴化培養基的24 孔板中進行下一輪馴化。在接下來馴化和篩選過程中,甘油質量濃度逐漸增加至100 g/L。將高通量篩選獲得的菌株按方法 1.1.2 培養成種子液,按體積分數10%的接種量接種到發酵搖瓶中,于30 ℃、200 r/min 培養120 h。測定各菌株β-葡聚糖產量及分子質量,篩選產低分子質量β-葡聚糖的菌株。

1.3 遺傳穩定性實驗

將獲得的Agrobacteriumsp.WS-8E3T連續傳代,在搖瓶中于30 ℃、200 r/min下培養120 h,測量每一代 β-葡聚糖分子質量、產量、微生物數量,驗證Agrobacteriumsp.WS-8E3T的遺傳特性是否穩定。

1.4 不同分子質量多糖的制備

對發酵液進行乙醇分級沉淀操作(圖1)提取多糖,通過冷凍真空干燥得到分級醇沉粗多糖。

圖1 乙醇分級沉淀步驟Fig.1 The steps of ethanol fractionation preciptipation

1.5 分析測定方法

1.5.1 總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[16]。

1.5.2 蛋白含量測定

利用紫外光譜掃描法,于200～500 nm進行紫外掃描測定純化多糖中蛋白質含量。

1.5.3 分子質量的測定

采用高效液相色譜法。色譜條件:配有2414 示差檢測器的Waters e2695 高效液相色譜儀；UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm)凝膠柱；流動相 0.1 mol/L NaNO3；流速0.95 mL/min；柱溫45 ℃；進樣體積15 μL。

1.5.4 單糖組成分析

按照LIU等[17]的方法稍作修改。將5 mg 樣品與2 mol/L 的三氟乙酸配制成5 mg/mL溶液于120 ℃金屬浴條件下水解,利用高效離子交換層析結合脈沖電流檢測器對單糖組成進行分析。

1.5.5 紅外光譜分析

利用壓片法將樣品粉末與干燥的KBr混合于瑪瑙研缽中并進行研磨,采用手動壓片的方式,在500～4 000 cm-1采集紅外光譜[18]。

1.5.6 核磁共振分析

利用0.5 mL D2O溶解20 mg多糖樣品,采用Agilent 400 MHz核磁共振儀進行測定,采集樣品的核磁共振光譜。

1.5.7 抗氧化活性的測定

1.5.7.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除活性的測定如韋錚[19]所述,略有調整。將2 mL DPPH溶液和2 mL無水乙醇以不同濃度添加到2 mL樣品溶液中。漩渦振蕩后于室溫下35 min避光反應,測定517 nm處的吸光度。通過公式(1)計算DPPH自由基清除率：

(1)

式中：Ri,多糖溶液(2 mL)和 DPPH(2 mL)溶液混合后的吸光度值;Rj,多糖溶液(2 mL)和無水乙醇(2 mL)的吸光值;R0,DPPH溶液(2 mL)和無水乙醇(2 mL)的吸光值。

1.5.7.2 ·OH清除率的測定

測定510 nm處的吸光度[20],用蒸餾水較零。按公式(2)計算：

(2)

式中：Qi,多糖溶液的吸光度;Qj,樣品溶液在蒸餾水中的吸光度;Q0,蒸餾水吸光度。

1.5.7.3 還原力的測定

參照鐵氰化鉀法[21]。

1.6 數據處理與分析

采用Origin 8.5軟件繪制圖表并進行數據分析,KEGG分析代謝途徑。

2 結果與分析

2.1 適應性馴化篩選結果

β-葡聚糖與堿性剛果紅溶液的結合具有高序匹配性,室溫下可以形成紅色物質[22]。根據此特點,利用剛果紅鑒別平板對菌種進行挑選,選擇透明、凸起、菌落大、紅色深的130株菌株進行24孔板高通量篩選,以β-葡聚糖產量和分子質量為指標,從中選取具有高菌種活力、高產量及低分子質量的12株菌株進行搖瓶復篩。復篩結果如圖2所示。經過搖瓶復篩,發現在分子質量差異較小的前提下,有4株菌在100g/L發酵培養基中產β-葡聚糖的量較高,其中編號為 8E3T的菌株發酵產β-葡聚糖穩定性較高。將其命名為Agrobacteriumsp.WS-8E3T。

圖2 搖瓶復篩結果Fig.2 Rescreening results of shaking flask

2.2 遺傳穩定性

工業生產中菌種經過連續多次傳代后,會出現菌種退化而致使生產性能下降的情況。為驗證Agrobacteriumsp.WS-8E3T 的穩定遺傳特性,連續傳代培養了6次,測定各代發酵參數,實驗結果如表1 所示。從表1 可以看出,該菌株在搖瓶發酵培養基發酵120 h后,菌體量在(3.07±0.17) g/L,β-葡聚糖產量在 1.39 g/L,可穩定產生分子質量在2 800～3 600 Da之間的新型低分子質量多糖BGOs,各項指標較穩定,具有較好的穩定性。

表1 Agrobacterium sp.WS-8E3T 的遺傳穩定性測試Table 1 Genetic stability test of Agrobacterium sp.WS-8E3T

2.3 代謝途徑分析

馴化株Agrobacteriumsp.WS-8E3T可以利用甘油生長并合成低分子質量β-葡聚糖,而甘油在土壤桿菌中代謝途徑鮮有報道,但在Agrobacteriumsp.CGMCC 11546全基因組序列中卻可查到甘油代謝相關基因,這是一種glp系統編碼的沉默甘油分解代謝途徑。基于此,初步繪制了土壤桿菌中甘油合成低分子質量β-葡聚糖的代謝途徑(圖3)。

如圖3所示,甘油在通道蛋白協助下進入菌體內部,然后在甘油磷酸化激酶、3-磷酸甘油脫氫酶、磷酸戊糖異構酶的作用下形成3-磷酸甘油醛,進入糖酵解及糖異生途徑,在糖異生途徑中,3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮在1,6-二磷酸果糖激酶的作用下產生的6-磷酸果糖異構化為6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖變位成1-磷酸葡萄糖進入合成途徑,在糖酵解途徑中,3-磷酸甘油醛進入三羧酸循環途徑[23]提供菌體生長和BGOs合成所需能量。結果顯示,當馴化菌株以甘油為底物進行發酵時,合成BGOs的產率較低,原因可能是在代謝途徑中的兩段分支共存的條件下,大量ATP、UTP、(NADH+H+)、多種酶的合成所需Mg2+及能量因子的消耗降低了BGOs的合成能力。

圖3 Agrobacterium sp.WS-8E3T利用甘油合成 BGOs代謝途徑Fig.3 Metabolic pathway of Agrobacterium sp.WS-8E3T using glycerol for BGOs

2.4 產物組成及結構分析

2.4.1 紫外光譜分析

圖4 多糖的紫外光譜圖Fig.4 UV spectra of polysaccharides

從圖4可以看出,在波長280 nm處[24]沒有紫外吸收,說明經純化得到的BGOs中蛋白質含量可以忽略不計,對后續分子特性實驗無影響。

2.4.2 單糖組成及紅外光譜分析

使用離子色譜儀和傅里葉紅外光譜對新型多糖BGOs的單糖組成和官能團結構進行分析,結果見圖5。

離子色譜儀共對比了8種單糖,各個組分的保留時間如圖5-a所示。經測定,BGOs樣品中只含有一組峰,其保留時間與標準糖混合溶液中的葡萄糖的保留時間相同,證明了樣品是僅由葡萄糖單體組成的聚合物。

傅里葉紅外光譜可以對糖苷鍵類型進行初步判斷,例如吡喃型糖環只有2個特征強吸收峰、β-和β-吡喃型糖苷鍵分別在840和890 cm-1有特征吸收峰[17]。按照1.1.5所述的方法,對BGOs的官能團信息和糖苷鍵類型進行分析,特征吸收峰結果如圖5-b 所示。BGOs在波數890.6和1 272.2 cm-1處有特征吸收峰,而在840和790 cm-1處無吸收峰,說明BGOs為β-糖苷鍵構型。另外在波數為3 351.7(—OH)、2 893.7 (—CH3—或—CH2)、1 657.4及1 272.2 cm-1處有多糖的特征吸收峰,而在1 616 cm-1處無—NH2的吸收峰,說明不存在蛋白質多糖,與紫外掃描光譜一致。1 028.9、1 166.6 cm-1處的吸收峰表示BGOs中的糖環構型是吡喃型。由此推測,BGOs為β-吡喃型葡萄糖苷鍵鏈接的多糖。

a-單糖組成分析圖;b-紅外光譜圖 1-巖藻糖；2-鼠李糖；3-阿拉伯糖；4-半乳糖；5-葡萄糖； 6-木糖；7-甘露糖；8-果糖圖5 BGOs的單糖組成及紅外光譜分析Fig.5 The monosaccharide compositions analysis and FT-IR spectra of BGOs

2.4.3 核磁共振分析

核磁共振圖譜可以分析多糖的糖苷鍵型,比如:氫譜中,α型糖苷鍵質子信號一般小于5 ppm,α型糖苷鍵大于5 ppm,碳譜中,異頭碳和非異頭碳的信號主要分別出現在90～110和60～85 ppm處,C-1的出峰位置基于α-構型和β-連接的化學位移范圍分別是δ90-102和δ102-112[25]。按照1.5.6所述的方法,對BGOs的結構進行分析,結果如圖6所示。

由圖6-a可以看出,BGOs的H1質子信號出現在5.22 ppm處,說明是單一β-型糖苷鍵,且在5.22(s,1H,OH-6)、4.82(m,2H,OH-2,OH-4)、4.56(s,1H,OH-6)、3.92(s,1H,H-6)、3.65(m,2H,H-3,H-6)、3.43(m,3H,H-4,H-2,H-5) ppm 處出現異頭質子信號,說明BGOs是由單一的β-1,3-糖苷鍵相連。由圖6-b可以看出,BGOs只有一個異頭碳信號,且它的主干信號均出現在109.69 (C-1)、85.38 (C-3)、83.39 (C-2)、77.55 (C-4)、81.85(C-5) 以及72.47 (C-6) ppm處,說明 BGOs是沒有分支的單鏈。以上結果與紅外光譜和單糖組成分析結果一致。

a-1H-NMR;b-13C-NMR圖6 BGOs核磁共振圖譜Fig.6 NMR spectra of BGOs

2.5 分子質量分析

高效凝膠過濾色譜法測定了純化后多糖的分子質量(Mw)與保留時間(t)關系,以lgMw為縱坐標,t為橫坐標,多糖分子質量的標準曲線如圖7-a所示,為lgMw=-0.141 1t+6.068,R2=0.997 4。

a-多糖分子質量標準曲線;b-BGOs的高效凝膠色譜圖圖7 高效凝膠色譜圖Fig.7 High performance gel chromatogram

BGOs分子質量如圖7-b所示,樣品的保留時間為18.167 min,由標準曲線計算得出其相對分子質量為3.218 kDa,研究表明,低分子質量β-葡聚糖更容易發揮其多功能性[26],通過適應性馴化的菌株利用甘油生產的BGOs分子質量分布均勻,將具有廣闊的市場應用潛力。

2.6 抗氧化性能研究

2.6.1 DPPH自由基清除率

多糖溶液與DPPH自由基反應生成紫色,顏色變化程度與多糖清除自由基的能力有一定的劑效關系[27]。BGOs對DPPH自由基清除能力如圖8-a所示。在與BGOs濃度相近的濃度下,抗壞血酸具有較高的DPPH自由基清除能力。當多糖質量濃度為1.0 mg/mL時,BGOs對DPPH自由基的清除能力接近(78.95±2.35)%,且增長趨勢趨于平緩,許女等[28]研究表明,雞腿菇子實體多糖質量濃度為2.0 mg/mL時,對DPPH自由基清除率為48.4%,說明BGOs在較低濃度下即可達到食用菌多糖同等效果。

2.6.2 ·OH清除率

圖8-b顯示,BGOs具有較強的·OH清除能力,這一發現與DPPH自由基清除能力的結果一致,在實驗濃度范圍內,BGOs對·OH的清除程度為(80.5±1.4)%。隨著BGOs濃度的增大,·OH清除率隨之增大,并且表現出了一定的伴隨性。

2.6.3 鐵還原力

在鐵還原體系中,具有強還原力的多糖可以還原Fe3+為Fe2+,因此可以通過顏色變化(吸光值的變化)來判斷多糖的還原能力。由圖8-c可知,隨著底物濃度的增加,BGOs呈現出一定程度的還原作用,當多糖質量濃度為1.0 mg/mL時,吸光值達到(1.70±0.04),說明BGOs可以作為一種良好的電子供應者。綜上所述,通過對不同濃度BGOs作用下各抗氧化性指標的檢測,表明BGOs具有良好的抗氧化活性。

a-BGOs的DPPH清除速率;b-BGOs的·OH清除速率;c-BGOs的還原力圖8 抗氧化活性測定Fig.8 Determination of antioxidant activities

3 結論

本研究將甘油作為碳源,采取梯度馴化的方法,通過40、60、80、100 g/L甘油連續傳代培養選育,結合剛果紅平板初篩、高通量篩選和搖瓶復篩的方法,以初始產率及分子質量為目標,篩選獲得了1株以甘油為碳源、可穩定獲得低分子質量多糖的高活力菌株Agrobacteriumsp.WS-8E3T,該菌株在100 g/L甘油質量濃度下發酵120 h,可穩定產生分子質量在2 800～3 600 Da的新型低分子質量多糖BGOs。經過結構鑒定,判斷該BGOs為β-1,3-葡聚糖,并具有一定的抗氧化活性。在實驗濃度范圍內,BGOs的DPPH自由基和·OH清除效果可達到抗壞血酸的80%,還原力可達到抗壞血酸的50%,隨著質量濃度的增加,呈現出一定的濃度依賴性,表明其具有良好的抗氧化活性。

研究結果顯示,通過馴化的方式獲得低分子質量多糖具有可行性。該多糖呈現出的抗氧化活性,體現出了其作為功能性多糖的多應用性。此外還需進一步優化培養基組成、探索代謝途徑中相關基因的表達,以提高BGOs的產量并探究BGOs的潛在功能性,進一步確定BGOs作為新型營養素、食品添加劑或抗氧化補充劑的適用性。