植物乳桿菌AR113與青霉素對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠結腸炎治療效果對比分析

田苗新,邵君琳,王光強,熊智強,張匯,宋馨,艾連中,夏永軍

(上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海食品微生物工程技術研究中心,上海,200093)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性的、反復發作的腸道炎癥疾病。IBD主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)兩種表型[1]。IBD發病機制是多因素的,包括腸上皮屏障破壞、免疫應答紊亂、腸道菌群變化等[2],但具體發病機制仍不清楚。在治療IBD過程中服用的藥物會引起多種副作用[3]。因此,研究IBD發病機制并探索降低治療副作用的方法至關重要。

益生菌是緩解IBD的有效途徑。益生菌可通過改善腸道屏障、降低腸道pH、調節腸道菌落組成等方式緩解結腸炎癥狀[4]。益生菌攝入可調整腸道菌群多樣性,改善結腸炎引發的生態失調[5-6]。但高劑量攝入益生菌會加重小鼠結腸炎[7]。益生菌調節腸道菌群對機體產生影響的機理尚不清楚。結腸炎發病過程中,腸道受到外來物或致病菌刺激,導致腸道屏障、炎癥水平等發生顯著改變。抗生素通過干擾腸道菌群,改變腸道敏感性,降低腸道菌群復雜性,達到治療疾病的目的,但抗生素的攝入會干擾腸道菌群定殖能力,與益生菌聯合服用可能導致復雜的相互作用,改變腸道代謝及免疫[8-9]。

前期研究表明,植物乳桿菌AR113可以較好地緩解葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的結腸炎癥狀,通過調節TLR4-NF-κB途徑降低腸道炎癥水平,改善腸道菌群組成,維持腸道屏障完整性[10]。本文考察青霉素干預及青霉素與植物乳桿菌AR113聯合處理對小鼠結腸炎的影響,為解析植物乳桿菌AR113緩解結腸炎奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

C57BL/6 J小鼠,SPF級,日齡28～35 d,由上海杰斯捷實驗動物有限公司(中國上海)提供,許可證號：SCXK(滬)2013—0006。

1.2 實驗菌株

植物乳桿菌AR113篩選自四川泡菜,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),菌種保藏號：No.13909。

1.3 實驗主要試劑

葡聚糖硫酸鈉(MW：36 000～50 000),MP Biomedicals；便隱血試劑盒,貝索企業；5-氨基水楊酸,源葉生物；青霉素G鈉鹽、Trizol,生工生物；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒,南京建成；反轉錄試劑盒,南京諾唯贊;qPCR SYBR Green Master Mix,翊圣生物；引物由華大基因合成。

1.4 主要儀器設備

RM 2016病理切片機,德國Leica；JK-6組織攤烤片機,武漢俊杰；E100顯微鏡,尼康；550D數碼單反相機,佳能；L500低速離心機,湖南湘儀；Nano Drop 2 000分光光度計,Thermo Scientific；S1000梯度PCR儀,美國伯樂Bio-rad；LightCycler96實時熒光定量PCR儀,羅氏制藥。

2 實驗方法

2.1 動物分組及處理

雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養一周，每籠8只，飼養溫度(22 ± 2)℃，相對濕度(50±5)%，循環12 h光照/黑暗。動物實驗選用3% DSS造模。48只小鼠隨機分為6組，分別為正常組(Control)、模型組(DSS)、陽性對照組(DSS+5-ASA)、AR113組(DSS+AR113)、青霉素干預組(DSS+Pen)、青霉素與AR113聯合組(DSS+Pen+AR113)(青霉素干預后灌胃植物乳桿菌AR113)。

小鼠適應1周后，青霉素干預組、青霉素與AR113聯合組自由飲用1 g/L的青霉素鈉鹽水溶液3周，其余各組飲用無菌水3周。隨后所有實驗組自由飲用無菌水3 d后，小鼠自由飲用3% DSS水溶液造模7 d，造模第5天開始到第14天，陽性對照組灌胃5-氨基水楊酸(5 g/L)，AR113組、青霉素與AR113聯合組灌胃植物乳桿菌AR113(1×109CFU/mL)，其余各組灌胃無菌水。本研究遵循動物試驗委員會所制訂的倫理學標準，批準文號為倫審-KYSB-2016-97。實驗流程如圖1所示：

圖1 實驗流程圖Fig.1 Experimental protocols

2.2 小鼠疾病活動指數(disease activity index,DAI)的測定

DAI評分基于 MURTHY 評分系統[11]。DAI 包括3個部分：體重變化、便血情況和糞便性狀。選用便隱血試劑盒測糞便中的潛血。具體評分標準如表1所示：

表1 疾病活動指數評分標準Table 1 Disease activity index scoring standards

2.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H&E)染色及阿利新藍染色

采用阿利新藍將結腸黏液層的黏蛋白染成藍色,評估結腸黏蛋白變化[12]。H&E 對結腸染色進行形態學評估[13]。根據炎癥、隱窩損傷程度、黏膜損傷和病變范圍對H&E染色照片進行組織損傷評分。組織損傷評分標準如表2所示：

表2 組織損傷評分標準Table 2 Histological score standards

2.4 MPO測定

根據南京建成MPO試劑盒說明書進行測定。

2.5 結腸組織mRNA表達量測定

Trizol法提取結腸組織總RNA,根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。根據qPCR SYBR Green Master Mix使用說明對腸道相關基因進行PCR擴增和檢測。所涉及的引物序列如表3所示,以β-actin作為內參,采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

2.6 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件分析數據,實驗結果均采用均值±標準偏差(Mean±SD)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 小鼠DAI與體重變化

DAI表征小鼠結腸炎發展狀況。研究結果顯示(圖2),隨著DSS攝入,模型組小鼠體重逐漸降低,AR113組與陽性對照組能夠顯著減緩小鼠體重降低。但青霉素干預組與聯合處理組在實驗周期內體重無顯著降低,變化趨勢與正常組小鼠一致(圖2-a)。與模型組小鼠相比,AR113組能夠顯著降低結腸組織DAI評分,而青霉素干預組以及聯合處理組DAI評分變化無顯著差異,顯著低于模型組以及AR113組,變化趨勢與正常組接近(圖2-b),這與體重監測結果一致。實驗結束時,各組小鼠體重與DAI存在顯著差異(圖2-c、d)。

a-實驗周期內小鼠體重變化；b-實驗周期內小鼠DAI變化；c-實驗結束時各組小鼠體重差異；d-實驗結束時各組小鼠DAI差異圖2 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠體重及疾病活動指數的影響Fig.2 Effects of penicillin and Lactobacillus plantarum AR113 on body weight and disease activity index of mice

3.2 青霉素及植物乳桿菌AR113對腸道活性及結腸長度影響

MPO是只存在于中性粒細胞和單核細胞中的顆粒血紅素酶。中性粒細胞是急性炎癥的標志,當病原體侵入時,中性粒細胞將病原體吞噬,保證機體的正常運行[14]。故檢測結腸中MPO活性表征小鼠結腸炎癥程度。研究結果表明,模型組小鼠MPO活性顯著升高,AR113組MPO活性最低；青霉素干預組與聯合處理組也能夠顯著降低MPO活性,可使其恢復到正常組水平且兩組間無顯著差異(圖3-a)。結腸長度變化可表征小鼠炎癥程度。模型組小鼠結腸長度顯著降低,與MPO結果相一致,青霉素干預組以及聯合處理組得到有效緩解,結腸長度恢復到正常水平(圖3-b)。

a-小鼠結腸MPO活性；b-結腸長度圖3 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸MPO 活性及結腸長度的影響Fig.3 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on MPO activity and colon length in mouse colon

3.3 結腸組織H&E染色及組織損傷評分

小鼠攝入DSS后引起結腸組織發生炎癥反應,如圖4-a所示。模型組結腸上皮組織結構破壞,中性粒細胞數量增多,出現隱窩消失。灌胃AR113后,小鼠結腸上皮組織結構恢復良好,顯著減少中性粒細胞數量,與DIN等[15]研究結果一致。青霉素干預組以及聯合處理組小鼠結腸組織同樣得到良好恢復。組織評分顯示(圖4-b),模型組組織損傷評分顯著高于對照組,灌胃AR113后組織損傷程度降低,而經過青霉素以及聯合治療后,小鼠結腸組織損傷程度最低,且兩者無顯著差異。

a-結腸HE染色圖;b-結腸組織損傷評分 1-正常組；2-模型組；3-陽性對照；4-AR113組；5-青霉素干預； 6-青霉素與AR113聯合圖4 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸組織的影響Fig.4 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on mouse colon tissue

3.4 青霉素及植物乳桿菌AR113對腸道上皮黏液層影響

腸道上皮黏液層對腸道組織具有保護作用,是一個由黏液蛋白組成的復雜結構。其中黏蛋白MUC2是由腸道上皮組織杯狀細胞分泌,用于保護腸道及維持腸道穩態[16]。阿利新藍可與MUC2結合,表征腸道上皮黏蛋白含量[17]。由圖5-a可知,由于模型組結腸上皮組織結構被破壞,大量杯狀細胞損傷,導致黏蛋白分泌量明顯減少,與H&E染色與組織損傷評分結果一致。灌胃AR113后,結腸組織結構恢復,黏蛋白MUC2含量明顯增加；與模型組相比,青霉素干預組與聯合處理組黏蛋白MUC2含量也出現增加,但是含量低于AR113組。qPCR結果顯示(圖5-b),灌胃AR113黏蛋白合成基因MUC2表達量顯著上升,且表達量在各組中最高,黏蛋白含量顯著增加。青霉素干預組以及聯合處理組經過治療后,黏蛋白合成基因MUC2表達量恢復到正常水平,且兩組間無顯著差異。抗生素處理后,服用植物乳桿菌AR113不會干擾腸道上皮細胞黏液層恢復,但抗生素會降低黏液層的恢復效果。

a-結腸阿利新藍染色;b-結腸MUC2蛋白相對表達水平 1-正常組；2-模型組；3-陽性對照；4-AR113組；5-青霉素干預； 6-青霉素與AR113聯合圖5 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸黏液層的影響Fig.5 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on mucus layer of mouse colon

3.5 青霉素及植物乳桿菌AR113對結腸炎癥因子水平影響

機體正常狀態下,免疫系統維持穩態。當機體受到外界干擾時,免疫細胞受刺激,釋放炎癥因子作為信號分子,刺激相關細胞調節機體免疫,使機體恢復正常狀態[18-19]。如圖6所示,DSS造模后,模型組小鼠結腸組織損傷,促炎因子TNF-α、IL-6表達顯著增加(圖6-a、b),抑炎因子IL-10表達量有一定降低(圖6-c),但不顯著。灌胃AR113后,小鼠促炎因子TNF-α、IL-6表達顯著降低(圖6-a、b),抑炎因子IL-10表達顯著升高(圖6-c)。青霉素干預組以及聯合處理組治療后,炎癥因子變化趨勢無顯著差異,兩組均能夠顯著降低TNF-α基因表達量(圖6-a),且表達水平顯著低于AR113組,但是抑炎因子IL-10表達水平顯著低于AR113組(圖6-c)。利用無菌小鼠進行DSS造模,小鼠無明顯結腸炎癥狀,而正常小鼠則出現嚴重結腸炎癥狀,說明腸道菌群可能介導小鼠結腸炎發病[20]。SOVRAN等[21]研究表明,抗生素可顯著影響真菌對DSS誘導小鼠腸炎模型的治療效果。分析腸道菌群顯示,真菌治療效果受腸桿菌影響。萬古霉素處理小鼠后,殺滅腸道中的腸桿菌,造成小鼠對DSS誘導不敏感,降低結腸炎發病率。因此,青霉素攝入可能通過有效降低促炎菌群,從而抑制促炎因子的表達,降低炎癥水平[22]。

a-TNF-α mRNA相對表達水平；b-IL-6 mRNA相對表達水平； c-IL-10 mRNA相對表達水平圖6 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸炎癥因子表達水平的影響Fig.6 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on the expression of inflammatory factors in the colon of mice

4 結論

益生菌與抗生素常用于炎癥性腸病緩解治療,兩者治療腸炎作用機制有所差異。植物乳桿菌AR113可以有效緩解小鼠結腸炎癥,恢復損傷的杯狀細胞,增加黏蛋白MUC2分泌,同時顯著提升小鼠結腸抑炎因子IL-10表達,激活腸道免疫系統。青霉素干預組與聯合處理組小鼠結腸癥狀以及大部分指標并無明顯差異,均能夠有效降低結腸促炎因子TNF-α表達,恢復腸道黏液層。青霉素干預處理在一定程度上鈍化DSS誘導結腸炎敏感性。但與灌胃AR113相比,青霉素處理會降低杯狀細胞恢復,影響黏蛋白MUC2分泌,并降低結腸抑炎因子表達。益生菌攝入能夠有效恢復結腸炎癥狀,在一定程度上能夠替代抗生素對結腸炎的治療。