APAP誘導小鼠急性肝損傷中免疫細胞的動態變化

包玉龍

(內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110)

APAP具有止痛和解熱特性，是最常用的藥物之一。推薦劑量下，安全有效，而過量可能導致急性藥物性肝損傷(DILI)[1]。實際上，APAP引起的肝損傷是許多國家DILI的最主要原因，占美國所有肝損傷病例的近50%和英國的60%[2-3]。盡管通常可以通過停止服用APAP來改善，但在某些情況下，嚴重APAP所致肝損傷可以致命[4]。

人類肝臟包含多達1010個常駐淋巴細胞[5],由B細胞、T細胞、自然殺傷(NK)、自然殺傷T(NKT)細胞組成。NK/NKT細胞、巨噬細胞的病理作用已經使用APAP誘導肝損傷小鼠模型進行了深入研究[6]。淋巴細胞募集，炎癥增加，炎癥的性質和程度決定了損傷的進展和嚴重程度，同時，DILI與淋巴細胞浸潤有關。然而，這些細胞在損傷發病機制中的確切作用仍存在爭議[7]。目前，關于肝巨噬細胞的作用，已經證明這些細胞通過產生促炎細胞因子和介質，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β和一氧化氮，促進APAP誘導肝毒性。肝巨噬細胞還通過產生細胞因子和介質（如IL-10、IL-6和IL-18結合蛋白）發揮保肝作用，這些蛋白可以對抗炎癥事件并促進肝臟再生[8]。與巨噬細胞一樣，中性粒細胞也會在組織損傷后清除細胞碎片。調節性T細胞對控制自身反應性T細胞和緩解炎癥具有重要的意義。它們能夠維持穩定的慢性炎癥并防止爆發性組織破壞。肝內調節性T細胞的頻率和功能影響慢性病毒性肝炎和肝損傷的結果，肝臟中調節性T細胞和效應T細胞的募集和存活之間的平衡可能決定DILI的結果[9-11]。然而，以往的研究多數都局限在肝臟損傷過程中的某一個時相中，目前對于APAP誘導急性肝損傷過程中的各類免疫細胞的動態變化尚未見報道。因此研究對APAP誘導急性肝損傷過程中代謝時相、損傷時相和修復再生時相中固有免疫細胞和適應性免疫細胞的動態變化情況具有重要的臨床指導意義，為進一步揭示APAP急性肝損傷的發病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。選擇6周齡的雄性C57BL/6野生型小鼠作為實驗動物，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 試劑。APAP（Sigma,美國），ALT、AST ELISA試劑盒（南京建城生物有限公司）,TNF-α和IL-1 ELISAELISA試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司),FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、FITC-CD3、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25流式抗體（Abcam,美國）,DAB試劑盒、HE染色試劑(福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.1.3 儀器。智能型高效離心機(Beckman Coulter,美國),超純水制造系統(四川優普超純科技有限公司),流式細胞儀(Beckman Coulter,美國),酶標儀（Bioteck,美國）,倒置顯微鏡(Nikon,日本),切片機、包埋機、攤烤片機(Leica,德國)。

1.1.4 培養基。RPMI-1640培養基(Sigma,美國)。

1.2 方法

1.2.1 急性肝損傷模型的構建。將雄性C57BL/6野生型小鼠在可控的室溫下飼養，溫度25±2℃，相對濕度55%±10%，進行12 h的明暗循環。將70只小鼠隨機分為2大組：對照組，模型組。模型組分為損傷后1、2、3、5、7、14、21 d為時間點，每個時間點有對照組5只，模型組5只。向模型組腹膜內注射APAP溶液（200 mg/kg），引起急性肝損傷。建模后的每個時間點，在小鼠中進行異氟烷麻醉，從眼球收集血液并解剖肝臟。在解剖前，確保小鼠停止進食12 h時并自由飲食。

1.2.2 ELISA法檢測生物化學指標。將血樣在4℃下凝結，并在3000 g離心15 min后從血樣中分離血清樣品，-20℃保存，用于ELISA檢測。

使用南京建城生物有限公司ELISA試劑盒，檢測血清中ALT和AST的水平，以反映ALT和AST的活性。

使用南京建城生物有限公司ELISA試劑盒檢測ALT、AST；使用江蘇酶標生物科技有限公司ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-1，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。在測定樣品前需繪制標準曲線，將標準品稀釋成1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.625 pg/mL濃度，各取100μL待測血清加到96孔板內，每孔重復3次，在室溫下孵育3 h。使用酶標儀在450 nm測定光密度，根據標準曲線計算血清ALT、AST、TNF-α和IL-1的含量。

1.2.3 HE染色。將切除的肝組織切成適當的大小，4%多聚甲醛固定，固定后石蠟包埋，將包埋后的組織切成4μm厚度，脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織。

1.2.4 流式檢測免疫細胞。取小鼠的相同肝葉，將其放入含1640培養基的培養皿中。用注射器塞子在200目過濾器上擠壓肝臟以獲得細胞懸液。將獲得的細胞懸液連續過濾到帶有200目的過濾器的15 ml離心管中，并以1000 r/min離心8 min。密封后，分別加入FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25抗體，在4℃下在黑暗中孵育30 min，離心收集細胞，重懸于PBS中,并上機檢測。

1.2.4 統計學分析。試驗數據以5只實驗動物的平均值±SD表示,采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。通過單因素方差分析進行分析，并進行Tukey檢驗，以檢驗各種處理之間的顯著差異,P＜0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 小鼠血清ALT、AST表達水平變化

ELISA法檢測血清中ALT、AST表達水平，從圖1可以看出，與對照組Con相比，高劑量APAP處理小鼠第1d時，小鼠血清中ALT、AST水平升高并已達到峰值（ALT為372.71±1.58 U/L；AST為143.78±13.81 U/L），從APAP處理第2d，ALT、AST表達水平明顯下降（ALT為106.03±21.42 U/L；AST為20.10±2.27 U/L），在APAP誘導小鼠肝損傷后第3~14日ALT、AST水平與對照組無差異（對照組：ALT為8.37±1.78 U/L，AST為13.18±3.67 U/L；第14d ALT為9.84±3.15 U/L，AST為9.61±0.97 U/L）（見圖1）。表明APAP誘導的肝損傷模型成功。

圖1 ALT、AST表達變化情況

2.2 APAP誘導急性肝損傷過程中組織病理學變化

利用光學顯微鏡觀察肝組織病理改變，病理檢測圖片如圖2所示。從圖中可以看出，APAP處理2 d肝門靜脈區1/3以上面積的肝細胞凝固型壞死。APAP處理5 d，損傷修復區肝靜脈至肝血竇軸系上可見大量炎性細胞浸潤，炎癥可造成肝損傷修復后炎癥的持續性損傷。APAP處理7 d炎癥消退，肝組織結構恢復正常，只是在少量靜脈區還存在一定的炎細胞浸潤（見圖2）。上述結果表明，APAP誘導的肝損傷第7日已基本完成肝損傷修復。

圖2 APAP誘導急性肝損傷中組織病理學變化

2.3 APAP誘導急性肝損傷過程中炎癥因子表達變化

ELISA法檢測血清中IL-1β、TNF-α的含量，從圖3可以看出，IL-1β對照組含量為37.21±0.25，TNF-α對照組為234.2±12.02。高劑量APAP處理小鼠第2 d時，小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平顯著升高，IL-1β升高至82.44±6.40，TNF-α為345.51±39.79（P＜0.05），在之后5d、7d、14d仍維持較高的水平（P＜0.05）（見圖3A、B）。表明IL-1β、TNF-α在肝損傷及肝損傷修復中起著主要的作用。

圖3 APAP誘導急性肝損傷中炎癥因子表達變化

2.4 APAP誘導急性肝損傷過程中固有免疫細胞動態變化

流式細胞術法測定肝臟組織中的NK細胞、巨噬細胞和樹突細胞含量，從圖4可以看出，與對照組相比（NK細胞數量254±22.11，巨噬細胞數量356.33±31.89），高劑量APAP處理小鼠第3日時，NK細胞、巨噬細胞水平顯著升高（NK細胞數量1353±50.76，巨噬細胞數量4640±122.87）（P＜0.05），從APAP處理第5日，NK細胞、巨噬細胞明顯下降（NK細胞數量547±172.81，巨噬細胞數量1063.33±221.22），并與對照組無明顯差異。而樹突細胞在APAP處理小鼠第2日顯著升高，對照組樹突細胞數量為3049.66±200.4，第2日為4532.43±187.54；從第3日開始明顯下降，第5日時（1577±312.78）與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。表明NK細胞、巨噬細胞和樹突細胞的數量在肝損傷及肝損傷修復過程中發生顯著的變化。

圖4 APAP誘導急性肝損傷過程中固有免疫細胞動態變化

2.5 APAP誘導急性肝損傷過程中適應性免疫細胞動態變化

流式細胞術法測定肝臟組織中成熟T淋巴細胞含量，從圖5可以看出，與對照組相比，高劑量APAP處理小鼠第5日時，CD3+成熟T細胞、輔助性CD3+CD4+T細胞和CD4+CD25+調節性T細胞數量顯著升高（P＜0.05），第7日仍處于較高狀態，與對照組有顯著差異（P＜0.05），第14日已降低，與對照組無差異。而對于抑制性CD3+CD8+T細胞而言，高劑量APAP處理小鼠第3 d時，細胞數量顯著升高（132.5±16.74）（P＜0.05），第5日和第7日仍處于較高狀態，與對照組（33±7.21）有顯著差異（P＜0.05），第14日已降低（56.67±4.18），與C無差異。表明，抑制性CD3+CD8+T和CD3+成熟T細胞、輔助性CD3+CD4+T細胞、CD4+CD25+調節性T細胞在肝臟修復不同時相產生動態變化。

圖5 APAP誘導急性肝損傷過程中適應性免疫細胞動態變

3 討論

肝臟是人體藥物代謝的場所，容易受到藥物代謝損傷，近年來藥物導致的肝損傷備受關注。APAP是臨床廣泛運用的陣痛解熱藥物，APAP過量是急性肝功能衰竭的最常見原因之一[12]。APAP所致肝損傷的時相分為三個階段，代謝時相，損傷時相和修復再生時相[13]。本文主要探討三個時相中，先天免疫細胞，包括巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞、樹突細胞、炎癥因子發揮的作用。

APAP肝損傷模型是一種顯著臨床相關性的藥物肝損傷模型[14]，在APAP肝損傷模型中，AST和ALT絕大部分分布在肝細胞內，當肝臟受損時，肝細胞膜破壞，AST和ALT進入血液，血液中AST和ALT水平升高[15]。本研究APAP處理后24 h，血清中ALT、AST水平升高并達到峰值，APAP組小鼠肝臟損傷明顯，表面有點狀充血、變性和壞死，說明造模成功。

從本實驗HE圖看出，肝臟第2日，第5日肝臟損傷，處于損傷時相，期間TNF-α、IL-1β升高，NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞第2日升高，第3日開始降低，CD3+成熟T細胞、輔助性CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD4+CD25+調節性T細胞從第5日升高。HE圖中肝臟第7日肝臟狀態與對照相當，處于修復再生時相，期間TNF-α、IL-1β仍處于較高狀態，NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞降低；CD3+成熟T細胞、輔助性CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD4+CD25+調節性T細胞仍處于較高狀態。IL-1β是巨噬細胞的產物，有研究發現[16-19]，APAP誘導的急性肝損傷模型中，IL-1β主要依賴NK細胞產生的TNF-α所誘導，從而導致嚴重的急性肝損傷。同時，肝臟巨噬細胞的作用一直在爭議之中。在本研究中，我們發現APAP處理后巨噬細胞，NK細胞在第3日顯著增加，隨后下降，樹突細胞在處理后的第2日明顯升高。也有研究表明[20]，樹突狀細胞耗竭也加劇了對乙酰氨基酚的肝毒性。從本實驗中也能夠看出，樹突細胞在損傷后第2日后開始急劇下降，肝臟損失嚴重。

研究還發現NK細胞可以通過殺傷非成熟的DC和分泌促炎癥因子，促進T細胞的活化并能招募免疫細胞到達感染部位[21-22]。本實驗中發現，成熟T細胞總數在5日開始急劇的增加，在第7日達到最高峰后，在14日時又恢復到對照組的水平。研究發現調節性T細胞對控制自身反應性T細胞和緩解炎癥很重要，它們維持穩定的慢性炎癥并防止爆發性組織破壞[17]。由此可以看出，在APAP急性肝損傷過程中，在損傷早期固有免疫細胞在炎性損傷中發揮重要作用，而在損傷修復期由成熟T細胞發揮主要作用。但其具體機制有待進一步研究。

4 結論

高劑量APAP處理小鼠后，血清中ALT、AST水平升高，肝細胞損傷。在APAP肝臟損傷不同時相中，固有免疫、適應性免疫發揮著不同的作用。壞死的肝細胞產生細胞因子IL-1β、TNF，在肝損傷修復期仍處于較高狀態；同時固有免疫細胞巨噬細胞、NK細胞、樹突細胞在損傷時相升高，修復再生時相降低至正常水平；T細胞發生動態變化，在損傷時相和修復再生時相處于升高狀態，14日后降低至正常狀態。本研究證實了肝損傷過程中，免疫因子、固有免疫細胞、適應性免疫細胞在肝損傷修復中的動態變化，并長時間觀察了APAP肝損傷的修復過程，但具體的關聯性仍需要進一步探索。