虛汗停顆粒對環磷酰胺模型大鼠免疫功能及腸道菌群的影響

寧娜 劉珊珊 黃秋凌 李燕舞 彭丹婷

摘要 目的：探討虛汗停顆粒對環磷酰胺模型大鼠免疫功能及腸道菌群的干預作用。方法：將SPF級SD大鼠隨機分為5組，分別為正常對照組、環磷酰胺模型組、虛汗停低劑量組（1.7 g/kg）、高劑量組（3.4 g/kg）、匹多莫德組（0.23 g/kg）。除正常對照組外，其他各組大鼠采用環磷酰胺腹腔注射制備免疫功能抑制模型。用流式細胞計數法檢測各組大鼠外周血淋巴細胞分類，ELISA法檢測血清免疫球蛋白IgG、IgM及補體C3、C4含量，16S rDNA測序檢測大鼠腸道菌群變化。常規固定大鼠脾臟，HE染色后光鏡下進行形態學觀察。結果：環磷酰胺模型大鼠外周血淋巴細胞中CD3、CD4、CD8細胞比例明顯降低，虛汗停高劑量組及匹多莫德組對環磷酰胺模型大鼠外周血淋巴細胞中CD3細胞比例有明顯提高，其他各組均無顯著變化。模型大鼠血清中IgG、IgM、C4含量明顯降低，虛汗停低劑量組及匹多莫德組模型大鼠血清IgG、IgM含量均顯著升高。腸道菌群檢測結果顯示，模型大鼠菌群結構與正常大鼠菌群明顯不同;藥物干預各組與模型組微生物結構的差異均有統計學意義（均P<0.01）。結論：虛汗停顆粒可以調節環磷酰胺模型大鼠腸道菌群結構，改善部分免疫功能及脾臟病理形態，體現了中藥復方多靶點效應，為臨床應用提供了實驗依據。

關鍵詞 虛汗停顆粒;免疫調控;環磷酰胺;匹多莫德顆粒;免疫細胞因子;16S rRNA基因測序;脾臟病理形態;腸道菌群

Effects of Xuhanting Granule on Immune Function and Intestinal Microflora of Cyclophosphamide Model Rats

NING Na1， LIU Shanshan2， HUANG Qiuling2， LI Yanwu3， PENG Danting1

（1 Guangzhou Baiyunshan Qixing Pharmaceutical Company Limited， Guangzhou 510530， China; 2 Guangzhou Baiyunshan Zhongyi Pharmaceutical Company Limited， Guangzhou 510530， China; 3 Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China）

Abstract Objective：To explore the effect of Xuhanting Granules on immune function and intestinal microflora of cyclophosphamide rats. Methods：A total of 50 rats were randomly divided into 5 groups：a normal control group， a cyclophosphamide model group， Xuhanting low， high dose groups （1.7 g/kg， 3.4 g/kg）， and a pidotimod group （0.23g/kg）. Except for the normal control group， the immunosuppressive model was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide. Flow cytometry was used to detect the classification of peripheral blood lymphocytes of rats， and ELISA method was used to detect the contents of serum immunoglobulin IgG， IgM and complement C3 and C4. 16S rDNA sequencing was used to detect the changes of intestinal flora in rats. The spleen of rats was fixed routinely， and morphological observation was carried out under light microscope after HE staining. Results：The proportion of CD3， CD4 and CD8 cells in peripheral blood lymphocytes of cyclophosphamide model rats was significantly decreased， and the proportion of CD3 cells in peripheral blood lymphocytes of rats with cyclophosphamide was significantly increased by xuhanding 3.4g/kg and pidotimod group. The contents of IgG， IgM and C4 in the serum of model rats were significantly decreased. The contents of IgG， IgM and C4 in serum of model rats were significantly increased by Xuhanting 1.7 g/kg and pidotimod. The results of intestinal microflora detection showed that the microflora structure of model rats was significantly different from that of normal rats， and there were significant differences in the microflora structure between the drug intervention groups and the model group （P<0.01）.Conclusion：Xuhanting Granules can regulate the structure of intestinal microflora and improve partial immune function and pathological morphology of spleen in cyclophosphamide model rats， reflecting the multi-target effect of traditional Chinese medicine compound， and provide experimental basis for clinical application.

Keywords Xuhanting Granules; Immunoregulation; Cyclophosphamide; Pidotimod granule; Immune cell molecule; 16S rRNA gene sequencing; Pathological form of spleen; Intestinal flora

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.009

虛汗停顆粒是根據《太平惠民和劑局方》中記載的名方“牡蠣散”化裁而成的中成藥，可顯著改善臨床患者自汗、盜汗癥狀。實驗研究表明虛汗停顆粒具有顯著的止汗、抗疲勞等藥理作用[1-2]。中醫認為，汗證多因衛表不固、腠理失司而致，脾居于中焦，為五臟之樞紐，脾的功能失調是汗證發生的重要原因[3]。免疫功能是中醫“脾”功能的部分體現[4]。傳統中藥以口服為主，首先與之接觸的是胃腸道，中藥進入腸道后與腸道菌群的相互作用與機體免疫功能密切相關[5]，菌群變化是中藥多靶點效應的切入點[6]。因此，本研究以免疫功能及腸道菌群調節為切入點，進一步探討虛汗停顆粒的藥效作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級SD大鼠50只，170～190 g，雌雄各半，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：44007200063727，許可證號：SYXK（粵）2018-0001。動物飼養場所：廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF級大鼠飼養室，許可證號：SYXK（粵）2013-0001。動物福利倫理委員會批準通過（倫理審批號：20190404002）。

1.1.2 藥物 虛汗停顆粒（廣州白云山奇星藥業有限公司，批號：18023B），其中藥包括黃芪、浮小麥、糯稻根、煅牡蠣、大棗。匹多莫德顆粒（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：181232）;注射用環磷酰胺（百特國際有限公司，批號：8J266D）。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠外周血淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限公司，批號：2019212）;FITC anti-rat CD4抗體（Biolegend，Inc，美國，批號：AB_313933）;PE anti-rat CD3抗體（Biolegend，Inc，美國，批號：AB_2563272）;FITC anti-rat CD8a抗體（Biolegend，Inc，美國，批號：AB_313974）;FITC anti-rat CD161抗體（Biolegend，Inc，美國，批號：AB_2564547）;大鼠IgG、IgM、C3、C4酶聯免疫檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20190617）。臺式離心機（湘儀，型號：TDZ5-WS）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將SD大鼠隨機分為5組，每組10只。分別為正常對照組、模型對照組、匹多莫德組、虛汗停低劑量組、虛汗停高劑量組。除正常對照組外其余4組大鼠腹腔注射35 mg/（kg·d）環磷酰胺，連續3 d，正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 干預方法 造模結束后，虛汗停低、高劑量組按1.7 g/kg、3.4 g/kg灌胃，匹多莫德組按0.23 g/kg灌胃。1次/d，連續7 d。

1.2.3 腸道菌群測序 末次給藥后無菌管采集新鮮大鼠糞便，液氮保存備用，進行16S rDNA菌群測序分析。采用Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序的方法，構建小片段文庫進行測序。通過對Reads拼接過濾，OTU聚類，并進行物種注釋和豐度分析，進一步進行Alpha多樣性分析、β多樣性分析及顯著物種差異分析等。

1.2.4 外周血IgM、IgG、補體C3、C4含量的檢測 腹腔靜脈取血（不抗凝）約2 mL，室溫靜置30 min，上機682×g離心，取血清，-20 ℃保存備用。采用酶聯免疫法檢測各組血清中IgM、IgG、補體C3、C4含量。

1.2.5 外周血淋巴細胞檢測 腹腔靜脈取血（肝素鈉抗凝）5 mL，按1∶1比例緩慢加入大鼠外周血淋巴細胞分離液（5 mL）上層，上機598×g離心;離心后吸取分離液與血漿之間的白色絮狀物即外周血淋巴細胞，加入清洗液清洗淋巴細胞2次。流式細胞儀檢測CD3、CD4、CD8及NK細胞比例。

1.2.6 脾臟指數及形態 稱取脾臟質量計算脾臟指數，取部分脾臟組織固定、切片、HE染色，顯微鏡下觀察脾臟形態變化。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件對研究數據進行分析，計數資料用百分率表示，采用χ2檢驗，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 虛汗停對各組大鼠血清IgM、IgG、補體C3、C4含量的影響 結果顯示，環磷酰胺模型大鼠（模型對照組）血清中IgG、IgM、C4含量明顯降低，匹多莫德組、虛汗停低劑量組可顯著上調模型大鼠血清IgG、IgM含量，對補體C4、C3無明顯作用。見表1。

2.2 虛汗停對各組大鼠外周血淋巴細胞中CD3、CD4、CD8及NK細胞比例的影響 結果顯示，環磷酰胺模型大鼠（模型對照組）外周血淋巴細胞中CD3、CD4、CD8、NK細胞比例明顯降低。經藥物干預，匹多莫德組及虛汗停高劑量組外周血淋巴細胞中CD3細胞比例升高，其他各組均無顯著變化。見表2。

2.3 虛汗停對環磷酰胺模型大鼠腸道菌群的影響結果顯示，各組樣本物種分類在門水平上以厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、變形菌門及放線菌門為主;在屬水平各組樣本物種分類比例有所不同，其中虛汗停低、高劑量組均可增加乳酸桿菌屬比例、降低擬桿菌屬比例。見圖1。Alpha多樣性分析顯示，各組樣品物種多樣性及豐度差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。菌屬水平采用PCoA分析顯示，模型對照組樣品的微生物組成結構明顯偏離其他各組，采用Binary Jaccard法計算樣品間的距離，結果顯示藥物干預各組與模型組微生物結構差異有統計學意義（P<0.01）。見圖3。組間樣品LEfSe分析顯示了不同組間差異有統計學意義的標志性菌群：正常對照組以雙歧桿菌、瘤胃球菌、放線菌、Gordonibacter、Turicibacter為優勢菌，而模型對照組以Allobaculum、Holdemanella、Stoquefichus為優勢菌，虛汗停不同劑量干預組對菌群的干預效應類似，優勢菌均表現為Cyanobacterium、Catenibacterium、Mitochondria、Luchmannii、Oxyphotobacteria等，匹多莫德干預組優勢菌表現為瘤胃球菌、Cyanobacterium、Muribaculaccac、Mitochaondria、Luchmannii、Turicibacter、Gordonibacter等。見圖4。

2.4 對脾臟指數及形態的影響 結果顯示，環磷酰胺模型大鼠（模型對照組）體質量顯著低于正常組，脾質量及脾臟指數（脾質量/體質量）無明顯變化，各藥物組干預對模型大鼠體質量、脾質量無顯著作用。見表3。形態學觀察顯示，正常大鼠脾臟白髓發達，環磷酰胺模型大鼠脾臟淋巴細胞減少，脾小結體積變小，小結周圍有多量巨噬細胞，各藥物干預組大鼠脾小結形態及淋巴細胞數量均有所恢復。見圖5。

3 討論

免疫抑制是機體免疫功能受損，對抗原應答能力下降的一種異常狀態，可表現出中醫“虛”的癥狀。虛汗停顆粒取自經典名方“牡蠣散”，在原著中用于“諸虛不足，及新病暴虛，津液不固”，其中黃芪、牡蠣是其核心藥對[7]。現代藥理學研究表明，黃芪具有調節免疫、強心、調節糖代謝及抗氧化等作用，黃芪多糖可提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能及外周血淋巴細胞轉化率[8-9]。牡蠣則具有保肝、抗疲勞及調節免疫功能等作用[10-12]。本研究發現，環磷酰胺大鼠模型可出現脾臟形態受損，脾小結及淋巴細胞減少，外周血淋巴細胞CD3、CD4、CD8細胞比例明顯降低，血清中IgG、IgM、C4含量明顯降低等免疫力低下表現。虛汗停干預可顯著提高環磷酰胺模型大鼠血清中IgG、IgM含量，上調環磷酰胺模型大鼠外周血淋巴細胞CD3比例，同時改善模型大鼠脾臟病理形態，提示虛汗停顆粒可促進環磷酰胺模型大鼠的免疫器官及免疫細胞功能的恢復。

人體的腸道菌群及其生存的腸道環境構成了腸道微生態，是人體最主要最復雜的微生態，其中腸道菌群占據腸道微生態的核心地位。腸道菌群與機體的免疫功能有密切的關系[13]。研究表明，中藥口服后在腸道內容物中駐留的未被吸收的藥物成分包括未被吸收的初生代謝產物和次生代謝產物，這些腸中移行成分可能刺激消化道內壁，產生免疫應答，或是干預和重塑腸道菌群，或是刺激菌群分泌生物活性物質產生效應[14-15]。中藥復方及中藥單體對腸道菌群的調節作用已成為研究熱點。研究表明，七味白術散不僅可促進雙歧桿菌、乳酸菌、酵母菌等有益菌的增殖，還可促進腸道營養物質的消化及吸收[16];補肺健脾顆粒可提高小鼠腸道內雙歧桿菌、乳桿菌和類桿菌的豐度，有利于維持腸道內環境平衡，增強人體抵抗力[17];四君子湯能夠抑制有害菌、促進有益菌增殖，恢復結腸炎大鼠的菌群平衡，促進短鏈脂肪酸的生產[18];補益類中藥（如黨參）含有皂苷類成分，這些成分可以促進腸道內雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌的生長，增加腸道中乙酸的含量，抑制有害菌的定植[19]。本研究發現，虛汗停顆粒不僅可以顯著調節環磷酰胺模型大鼠腸道菌群結構，使之趨于正常，還可以顯著增加乳酸桿菌、Cyanobacterium含量。值得注意的是免疫抑制模型大鼠腸道的優勢菌Holdemanella通常是一類致病菌，會增加其他細菌的感染，可分解腸道黏液，與炎癥介質IL-6、IL-1β、TNF-α水平正相關[20]。而藥物干預組（虛汗停、匹多莫德）中的優勢菌Cyanobacterium可以合成大量的次生代謝產物，包括具有抗菌、抗病毒、抗真菌和抗癌活性的生物化合物[21]。乳酸桿菌可以拮抗致病菌，有助于維持機體對抗原的細胞和體液免疫反應[22]。以上研究結果表明，虛汗停顆粒干預后的優勢菌屬對于機體免疫功能有正向調節作用，可能是藥物發揮效應的靶點之一。

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（2021-07-07收稿 責任編輯：吳珊，徐穎）