含氮雜環酸柏木酯合成與抑菌活性研究

孟斌斌，朱凱

(1.南京林業大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037； 2.南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210037)

杉木精油的主要成分為柏木醇、α-柏木烯、β-柏木烯等，通過結晶和重結晶,可得柏木醇等產品[1-4]。柏木醇為叔醇，空間位阻較大，雖可合成乙酸柏木酯、肉桂酸柏木酯和丙烯酸柏木酯等，但原料的位阻對叔醇酯化效率有明顯的影響[5-9]。

含氮雜環化合物在生物的新陳代謝和生理活動過程中有著非常重要的調節作用[10]。喹啉、吡啶、吲哚、嘧啶等含氮雜環衍生物具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲和消炎等多種生物活性，經常被設計建構在某些分子的結構上，賦予這些分子新的生物活性[11-14]。本文采用DCC/DMAP法催化酯化合成含氮雜環酸柏木酯，并對其抑菌活性進行研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

柏木醇(98%)，自制；瓊脂粉、蛋白胨、酵母提取物、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二環己基碳二亞胺(DCC)、氘代二甲亞砜、喹哪啶酸、吲哚-3-羧酸、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、碳酸鈉、石油醚、鹽酸、氯化鈉、無水硫酸鈉、溴化鉀、氫氧化鈉均為分析純；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由南京野生植物研究所提供；大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由本校實驗室提供。

YM系列不銹鋼智能型立式壓力蒸汽滅菌鍋；ZHWY-2102C型雙層小容量全溫度恒溫培養振蕩器；SHP-250型生化培養箱；AVANCE III 600 MHz型超導核磁共振譜儀；VERTEX 80V型全數字紅外光譜儀。

1.2 含氮雜環酸柏木酯合成

以柏木醇和含氮雜環酸為原料，通過DCC/DMAP催化酯化合成了含氮雜環酸柏木酯，合成路線如下：

1.2.1 喹哪啶酸柏木酯的合成與結構表征 取1 mmol 喹哪啶酸(0.176 7 g)與1.1 mmol DCC(0.229 3 g)加入10 mL二氯甲烷中，冰浴下攪拌0.5 h。加入1 mmol柏木醇(0.226 9 g)與0.1 mmol DMAP(0.012 3 g)的混合物，室溫攪拌24 h，反應結束。過濾，旋蒸得到固體產物，加入10 mL乙酸乙酯，4 ℃下放置12 h，過濾，以5%HCl溶液、10%Na2CO3洗滌，直至呈中性為止，再用飽和NaCl清洗，經無水硫酸鈉干燥后減壓蒸餾得到固體產物。粗品經柱層析純化(石油醚與乙酸乙酯體積比為4∶1)，得到白色粉末狀物質0.078 0 g，產率為21%。

1.2.2 吲哚-3-羧酸柏木酯的合成與結構表征 取1 mmol吲哚-3-羧酸(0.164 4 g)與1.1 mmol DCC(0.229 3 g)加入10 mL丙酮中，冰浴下攪拌0.5 h。加入1 mmol柏木醇(0.226 9 g)與0.1 mmol DMAP(0.012 3 g)的混合物，55 ℃下攪拌6 h。過濾，旋蒸得到固體產物，加入10 mL乙酸乙酯，4 ℃下放置12 h。 過濾，以5%HCl溶液、10%Na2CO3洗滌，直至呈中性為止，再用飽和NaCl清洗，經無水硫酸鈉干燥后減壓蒸餾得到固體產物。粗品經柱層析純化(石油醚與乙酸乙酯體積比為4∶1)，得到白色粉末狀物質0.082 5 g，產率為23%。

1.3 抑菌活性研究

采用濾紙片法測定樣品的抑菌圈，確定樣品的抑菌活性。

1.3.1 液體LB培養基的配制 在950 mL的去離子水中加入酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，以5 mol/L的NaOH調節pH至7.0，用去離子水定容至1 L，在103.4 kPa(15 psi)高壓下蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 固體LB培養基的配制 在950 mL的去離子水中加入酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，加熱融化，以5 mol/L的NaOH調節pH至7.0，用去離子水定容至1 L，在15 psi高壓下蒸汽滅菌20 min。

1.3.3 菌種的活化 取0.1 mL菌液加入10 mL LB液體培養基中，在37 ℃培養8～10 h，待用。

東柳院村全年日照為2710小時，幅射能量132856千卡，得天獨厚的自然能源為推進光伏扶貧創造了先決條件。武志鋒抓住機遇，獲得了光伏扶貧示范項目，總投資75萬元，總發電100KW，2017年3月建成發電，14個月已發電18萬度，創產值15.84萬元。他給深度貧困戶毎年每戶發放3000元；給重度殘疾人和80歲以上的老人毎年每戶補貼1000元；給本村考入本科大學的學生當年獎勵2000元、專科1000元。

1.3.4 濾紙片制備 選用吸水性強的優質濾紙，6 mm打孔機打下圓紙片，紫外燈下滅菌備用。

1.3.5 抑菌活性測定 無菌條件下，在直徑90 mm的培養皿中，加入20 mL冷卻到50 ℃的固體培養基(已加入1 mL活化后的菌液)，冷卻至室溫，將滅菌后的濾紙片沾取不同濃度的精油貼在營養平板上，濾紙間距離適中。同時，用丙酮作為對照。用封口膜將培養皿密封后，置于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h，測定其抑菌圈直徑。每組3次平行加空白對照實驗，3次重復。

2 結果與討論

2.1 對枯草芽孢桿菌的抑菌活性

柏木醇及含氮雜環酸柏木酯對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑見表1。

表1 不同樣品對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameter of different samples against Bacillus subtilis

由表1可知，3種樣品對枯草芽孢桿菌均有一定的抑制效果。其中喹哪啶酸和柏木醇濃度為2.5 mg/mL時就可達到對枯草芽孢桿菌的中度敏感。在濃度為5.0 mg/mL時，柏木醇、吲哚-3-羧酸柏木酯和喹哪啶酸柏木酯的抑菌圈分別為12，11，13 mm，3種樣品對枯草芽孢桿菌的抑制效果順序為喹哪啶酸柏木酯>柏木醇>吲哚-3-羧酸柏木酯。

2.2 對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

柏木醇及含氮雜環酸柏木酯對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑見表2。

表2 不同樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of different samples against Staphylococcus aureus

由表2可知，3種樣品對金黃色葡萄球菌均具有一定的抑菌效果，喹哪啶酸柏木酯的抑菌效果最好，濃度為5.0 mg/mL的條件下抑菌圈可達13 mm。 吲哚-3-羧酸柏木酯對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較差，在1.3 mg/mL的濃度下無抑菌效果。

2.3 對大腸桿菌的抑菌活性

柏木醇及含氮雜環酸柏木酯對大腸桿菌的抑菌圈直徑見表3。

表3 不同樣品對大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diameter of different samples against Escherichia coli

由表3可知，不同樣品對大腸桿菌均有一定的抑菌效果。柏木醇對大腸桿菌的抑制效果較差，在5.0 mg/mL的濃度下抑菌圈直徑為9 mm，為低度敏感。含氮雜環酸柏木酯對大腸桿菌在5.0 mg/mL的濃度下抑菌圈直徑在10 mm以上，為中度敏感。經過結構修飾的吲哚-3-羧酸柏木酯和喹哪啶酸柏木酯對大腸桿菌均有良好的抑制效果。3種樣品對大腸桿菌的抑制效果順序為喹哪啶酸柏木酯>吲哚-3-羧酸柏木酯>柏木醇。

3 結論

通過DCC/DMAP催化酯化合成了兩種含氮雜環酸柏木酯，濾紙片法抑菌活性研究表明，柏木醇及含氮雜環酸柏木酯均具有良好的抑菌活性，柏木醇對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在5.0 mg/mL的濃度下即可達到中度敏感。含氮雜環酸柏木酯對大腸桿菌有著良好的抑制作用，在5.0 mg/mL的濃度下抑菌圈直徑均在10 mm以上，為中度敏感，而柏木醇在同等濃度下只為低度敏感。經過結構修飾的含氮雜環柏木酯具有良好的生物活性，具備進一步研究作為廣譜抗菌劑的價值。