高效液相色譜法同時分析7%春雷霉素·噻霉酮可濕性粉劑

陳國珍，蘇華，張海娟，黨璐，鄭建斌

(1.陜西省石油化工研究設計院，陜西 西安 710054；2.西北大學 化學與材料科學學院，陜西 西安 710127)

春雷霉素屬于生物農藥，作為殺菌劑，具有同時預防和治療作用，對稻瘟病的防治效果較好。噻霉酮屬于有機雜環類化合物，以其高效、低毒等特點填補了國際、國內在該領域的空白，對真菌細菌類病害有很強的抑殺作用[1-4]。研究表明,二者的復配劑對番茄斑疹病菌的防治效果優于單劑[5]。歐盟規定春雷霉素最大殘留限量(MRL)為0.01～0.6 mg/kg， 噻霉酮最大殘留限量(MRL)為0.05～1 mg/kg。目前，國內外對兩者的檢測方法主要有：液相色譜串聯質譜法[6]、高效毛細管電泳法[7]、生物測定法[8]、高效液相色譜法(HPLC)等[9-10]。本研究采用HPLC法為春雷霉素和噻霉酮分析制定相關的國、行標奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

春雷霉素標準品(85.2%，國家農藥檢驗中心 沈陽)；噻霉酮標準品(97.0%，國家農藥檢驗中心 沈陽)；乙腈、甲醇均為色譜純；十二烷基硫酸鈉，分析純；7%春雷霉素·噻霉酮可濕性粉劑。

Waters 2695高效液相色譜儀；Millipore超純水機器；梅特勒XP 504分析天平；KQ-250DE超聲波清洗器。

1.2 色譜參數

色譜柱為150 mm × 4.9 mm(i.d.)不銹鋼柱，內裝Eclipse XDB-C18，5 μm填充物；流動相為甲醇-乙腈-水(0.6%十二烷基硫酸鈉，用磷酸調pH值為2.5)=40∶20∶40(v/v/v)，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；進樣體積10 μL；柱溫35 ℃。

1.3 標準溶液和樣品溶液的制備

準確稱取春雷霉素、噻霉酮標準品各0.02 g(精確至0.000 2 g)，于50 mL燒杯中，加入一定量超純水，用超聲波清洗器超聲溶解10 min，至標樣溶解完全，冷卻至室溫。轉入50 mL容量瓶，定容，搖勻。采用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

準確稱取試樣含春雷霉素和噻霉酮0.02 g(精確至0.000 2 g)，制備方法同標準樣品。

1.3.1 檢驗檢測 在上述1.2節分離檢測條件下，等基線平穩后，連續進數針標準品溶液，直至相鄰兩針標準品之間的響應值相對誤差小于1.5%時，按照標品、樣品、標品、樣品、標品的順序進行進樣檢測。

春雷霉素和噻霉酮標準樣品的高效液相色譜見圖1(A)，春雷霉素和噻霉酮樣品高效液相色譜見圖1(B)。

圖1 春雷霉素和噻霉酮標品

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

研究采用不銹鋼柱150 mm × 4.9 mm(i.d.)，所用色譜柱為Eclipse XDB-C18。采用不同比例甲醇-乙腈-水(0.6%十二烷基硫酸鈉，用磷酸調pH值為2.5)作為流動相。通過大量的實驗數據，綜合分離度、峰形以及保留時間等因素，流動相的最優化體積比為甲醇-乙腈-水(0.6%十二烷基硫酸鈉，用磷酸調pH值為2.5)=40∶20∶40(v/v/v)，流速為1.0 mL/min，春雷霉素和噻霉酮分離效果較好，且保留時間合適。

2.2 線性關系

在上述實驗條件下，配制一系列含有不同質量濃度春雷霉素(噻霉酮)標準品溶液進行實驗。分別以春雷霉素和噻霉酮標準溶液質量濃度C(g/L)為橫坐標，以春雷霉素和噻霉酮的峰面積A為縱坐標繪制標準曲線，見圖2。

圖2 春雷霉素(A)和噻霉酮(B)的線性關系Fig.2 Linear correlation of kasugamycin and benziothiazolinone

由圖2可知，春雷霉素的線性方程為y=4 248.2+4.0x，相關系數R2為0.999 7；噻霉酮的線性方程為y=88 817.3+1.2×107x，相關系數R2為0.999 6。實驗結果表明，春雷霉素、噻霉酮的質量濃度與峰面積之間具有良好的線性關系。

2.3 方法精密度的測定

對同一批次7%春雷霉素·噻霉酮可濕性粉劑，在1.2節色譜條件下，平行測定5次，結果見表1。

表1 春雷霉素和噻霉酮的相對標準偏差Table 1 Relative standard deviation(RSD) of kasugamycin and benziothiazolinone

由表1可知，春雷霉素和噻霉酮的標準偏差分別為0.8%和2.9%，相對標準偏差為0.396%和0.548%，結果表明所建立方法具有良好的精密度，可以用于實際樣品的檢驗檢測。

2.4 加標回收率

在7%春雷霉素·噻霉酮可濕性試樣中分別加入一定量的春雷霉素和噻霉酮標準樣品，在1.2節色譜條件下，測定春雷霉素和噻霉酮含量，加標回收率結果見表2。

表2 春雷霉素和噻霉酮加標回收率Table 2 Recovery test results of kasugamycin and benziothiazolinone

由表2可知，春雷霉素加標回收率在98.0%～101.8%之間，平均回收率為99.6%；噻霉酮加標回收率在98.9%～102.6%之間，平均回收率為101.2%。可知該方法可以準確分析制劑中春雷霉素(噻霉酮)的含量。

3 結論

建立了利用高效液相色譜法同時快速檢測春雷霉素、噻霉酮含量的方法。該方法具有分離效果好，線性關系良好，操作簡單等優點。能夠適用于質檢機構與生產企業對春雷霉素和噻霉酮的質量監督與控制，為春雷霉素和噻霉酮分析制定相關的國、行標奠定了基礎。