西羅莫司對肝臟熱缺血-再灌注損傷小鼠肝組織TLR4表達和細胞自噬功能的影響*

唐雙意，王希斌，丘 岳，覃福禮，張宏亮，蔣 霞

肝臟缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是指中斷的肝臟血供重新恢復(fù)血供灌注后所引起的肝組織損傷的病理生理過程[1,2]。肝臟I/R損傷是肝移植、肝切除和外傷后肝損傷的主要原因，然而目前臨床上針對肝臟I/R損傷仍缺乏有效的保護手段。西羅莫司是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，作為主要的免疫抑制劑在器官移植術(shù)后抗排異反應(yīng)中被廣泛應(yīng)用。在體內(nèi)，西羅莫司通過抑制哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)發(fā)揮免疫抑制活性。文獻[3]報道，在大鼠腎臟I/R損傷模型，西羅莫司能減少腎小球濾過率下降，減輕腎組織損傷。國內(nèi)報道[4]顯示，西羅莫司在大鼠肝臟I/R損傷過程中具有保護作用。然而，目前對西羅莫司抗I/R損傷的具體機制尚不完全清楚。本研究通過構(gòu)建小鼠部分肝臟I/R損傷模型，觀察了西羅莫司預(yù)處理的保護作用，并從Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導(dǎo)的免疫炎癥損傷和自噬方面探討了其可能的作用機制，以期為肝臟I/R損傷的治療尋找新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑與儀器 雄性Balb/c小鼠40只，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【合格證號：SCXK(京)2020-0029】。西羅莫司(美國Selleck公司，純度≥98%)；檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗小鼠TLR4抗體(Santa Cruz公司)；兔抗小鼠P65、抗p-P65、抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)、抗GAPDH抗體和HRP標記的羊抗兔二抗(美國CST公司)；兔抗小鼠P62抗體(Eptomics公司)；全自動酶標免疫分析儀(Biotex公司)；全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)；蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司)。

1.2 動物模型的制備 將40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機分為對照組、模型組、小劑量(1 mg.kg-1)和大劑量西羅莫司干預(yù)組(3 mg.kg-1)，每組10只。在西羅莫司干預(yù)組，分別于術(shù)前2 d開始腹腔注射給藥，連續(xù)2 d，在對照組和模型組，則給予等量的生理鹽水腹腔注射。手術(shù)當日，給予小鼠戊巴比妥60 mg.kg-1深度麻醉，仰臥位固定。消毒腹壁皮膚并于小鼠下腹部行T型切口，小心分離皮膚、剪開腹膜，充分暴露腹腔、解剖小葉韌帶后，以微血管夾阻斷Glison鞘的左支和中支，可見小鼠肝臟中葉和左外葉呈暗紅色或灰白色改變，而右葉顏色鮮紅不變。在60 min后，移除微血管夾，待缺血肝葉恢復(fù)血色后，縫合腹腔[5]；在對照組采用同樣的手術(shù)方式，但術(shù)中不使用微血管夾阻斷血供。恢復(fù)再灌注6 h后，每組取6只小鼠經(jīng)眼眶取血后處死，取肝組織，用生理鹽水充分沖洗并吸取表面水分，一部分置于10%福爾馬林中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，進行HE染色；另一部分使用2.5%戊二醛固定，制作電鏡切片，將其余肝組織置于-80℃冰箱保存。

1.3 血清指標檢測 使用全自動血生化分析儀及相應(yīng)的試劑盒檢測血清ALT和AST活力；采用ELISA法檢測血清TNF-α和IL-6。

1.4 肝組織蛋白表達檢測 取各組小鼠肝組織，加入組織裂解液，勻漿，提取蛋白，采用BCA法定量蛋白質(zhì)。取50 μg樣品蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，以GAPDH為內(nèi)參，分別加入抗TLR4、抗P65、抗p-P65、抗LCB-Ⅱ和抗P62抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次。最后，加二抗室溫下孵育2 h，采用ECL法顯色，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算各蛋白相對表達量。

1.5 肝組織自噬小體檢測 取約1mm3肝組織，使用2.5%戊二醛固定。超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色。使用Tecnai G2透射電子顯微鏡獲取圖像，隨機取每個肝臟樣本10張顯微照片，計數(shù)自噬小體總量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清AST和ALT水平比較 與對照組比，模型組小鼠血清AST和ALT水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量西羅莫司干預(yù)組小鼠血清AST和ALT水平均顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠血清AST和ALT水平比較

2.2 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn) 對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞呈條索狀排列，未見變性、壞死細胞；模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清，網(wǎng)狀纖維支架塌陷，細胞排列紊亂，胞質(zhì)疏松，細胞呈空泡樣變，可見大片狀肝細胞壞死，且炎性細胞浸潤明顯；在小劑量和大劑量西羅莫司干預(yù)組肝細胞空泡樣變和壞死程度有不同程度的減輕，炎性細胞浸潤均明顯減少(圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn)(HE，200×) A：對照組；B：模型組；C：小劑量干預(yù)組；D大劑量干預(yù)組

2.3 各組小鼠血清細胞因子水平比較 與對照組比，模型組小鼠血清TNF-α和IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量西羅莫司干預(yù)組小鼠血清細胞因子水平均顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠血清細胞因子水平比較

2.4 各組小鼠肝組織TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達情況 與對照組比，模型組小鼠肝組織TLR4蛋白表達和p-p65/p65比值均顯著升高(P<0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量西羅莫司干預(yù)組小鼠肝組織TLR4和p-p65/p65比值均顯著降低(P<0.05，圖2)。

圖2 各組小鼠肝組織TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達情況 與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05

2.5 各組小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白表達和自噬小體數(shù)量比較 與對照組比，模型組小鼠肝組織LC3B-Ⅱ和P62蛋白表達及自噬小體數(shù)量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量西羅莫司干預(yù)組小鼠肝組織LC3B-Ⅱ和P62蛋白表達水平及自噬小體數(shù)量均顯著增加(P<0.05，圖3)。

圖3 各組小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白表達和自噬小體數(shù)量比較 A：各組小鼠肝組織LC3B-Ⅱ和P62蛋白表達(Western blot)；B：各組小鼠肝組織LC3B-Ⅱ和P62蛋白相對表達水平；C：各組小鼠肝組織自噬小體數(shù)量(透射電鏡，6000×)；D：各組小鼠肝組織自噬小體數(shù)量比較與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05

3 討論

本研究采用手術(shù)夾閉小鼠Glison鞘左支和中支構(gòu)建部分肝臟熱I/R模型，模型制備獲得成功。肝組織學檢查顯示，模型組出現(xiàn)細胞排列紊亂，小葉結(jié)構(gòu)不清，細胞空泡樣變，炎性細胞浸潤等明顯異常表現(xiàn)，符合肝臟熱I/R損傷的病理學表現(xiàn)。另外，血清學檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組血清ALT和AST大幅升高，結(jié)合上述幾點可見本研究小鼠部分肝臟熱I/R損傷模型構(gòu)建成功。本研究在小劑量和大劑量西羅莫司預(yù)處理均可以有效降低小鼠血清ALT和AST活性，肝細胞變性和炎性浸潤明顯改善，提示該藥能明顯改善肝I/R病程學損傷。

肝臟I/R損傷是一種先天免疫系統(tǒng)主導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)，在肝臟I/R期間，損傷或壞死的細胞釋放損傷相關(guān)分子模式分子，進一步激活模式識別受體，從而誘導(dǎo)強烈的炎癥反應(yīng)和組織損傷[5-7]。TLR4作為一種重要的模式識別受體，研究[8]表明在肝臟I/R損傷中，炎癥和免疫反應(yīng)主要取決于TLR4的活化程度。另有研究[9]發(fā)現(xiàn)，在肝臟熱I/R損傷模型小鼠，TLR4信號通過招募下游MyD88蛋白介導(dǎo)了NF-κB的活化，擴大肝臟炎癥反應(yīng)并進一步引起肝細胞凋亡。NF-κB作為一種重要的細胞轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB磷酸化是其活化進入胞核與靶序列結(jié)合，促進靶基因表達的關(guān)鍵標志[10,11]。本研究在小劑量和大劑量西羅莫司干預(yù)組均可以明顯下調(diào)TLR4表達并抑制NF-κB(p65)的磷酸化水平，因此推測西羅莫司可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路激活，減輕小鼠肝臟I/R。西羅莫司還可以明顯下調(diào)血清TNF-α和IL-6水平，提示西羅莫司干預(yù)通過抑制NF-κB激活和隨后的炎癥反應(yīng)減輕了小鼠肝臟I/R損傷。

越來越多的證據(jù)表明，自噬參與了多種肝臟疾病過程，包括毒素和藥物誘導(dǎo)的肝損傷、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、病毒性肝炎和肝細胞癌等[12,13]。自噬被證實在肝臟I/R損傷中具有保護作用[14,15]，誘導(dǎo)自噬已成為I/R損傷后改善肝功能的潛在新策略。在肝臟I/R損傷過程中，自噬通過提供氨基酸和ATP等必要的生存物質(zhì)，使肝臟細胞在經(jīng)歷I/R時更容易適應(yīng)缺血和缺氧，從而減輕組織損傷。自噬能力受損或自噬小體數(shù)量不足是導(dǎo)致肝臟I/R損傷的關(guān)鍵機制之一[16]。LC3B-Ⅱ存在于自噬小體膜上，其表達增多使吞噬泡膜伸長并誘導(dǎo)出現(xiàn)自噬小體。自噬小體進一步與溶酶體融合產(chǎn)生自噬性溶酶體，降解攝入的細胞內(nèi)容物[17]。p62是一種泛素結(jié)合蛋白，能與自噬體膜蛋白結(jié)合，使得含有p62的蛋白聚集物能被結(jié)合至自噬小體上被分解[18,19]。本研究在恢復(fù)再灌注6 h時，西羅莫司干預(yù)組小鼠肝組織LC3B-Ⅱ和P62蛋白表達水平較模型組顯著升高。透射電鏡檢測自噬小體發(fā)現(xiàn)，西羅莫司預(yù)處理可誘導(dǎo)小鼠肝細胞自噬小體的產(chǎn)生。