慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清自噬相關蛋白水平及其臨床意義探討*

黃霜湘，姚朝光，藍 婧，歐 琴，覃冬林，陳麗芬，黃潔婕

肝衰竭可由病毒感染、酒精性、藥物性肝病和其他等原因引起，導致嚴重的肝臟合成、解毒、排泄和生物轉化功能障礙，臨床主要表現為凝血功能障礙、黃疸、腹水等，肝組織病理學特征為大塊肝壞死，臨床病死率可高達60%以上[1-3]。慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)是指在慢性肝病的基礎上出現新的肝細胞壞死性病變引起的肝衰竭，我國以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的ACLF(HBV-ACLF)最為普遍[4-6]。近年研究發現，HBV-ACLF臨床尚無特效治療藥物、病死率高，對患者預后進行準確的判斷，并適時開展人工肝支持系統或血液凈化治療，對合理利用醫療資源，改善患者預后意義重大。有關血清學指標預測肝衰竭患者臨床轉歸的研究報道較多，比如應用血清凝血酶原活動度、國際標準化比值(international standard ratio，INR)、血清膽堿酯酶和C反應蛋白等一系列肝功能指標或細胞因子以判斷肝損害或肝衰竭患者的預后[7，8]。然而，由于發病機理的復雜性，這些指標對患者預后轉歸的判斷價值都存在局限性，因此需要更多研究來發現更多的相關因子。自噬是過量物質或損壞或老化的細胞器被分解的過程，在ACLF等肝臟疾病的發生、發展過程中發揮重要的作用。p62、Beclin1和微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)為自噬相關蛋白，但較少用于HBV-ACLF患者預后的評估[9，10]。本研究探討了應用血清自噬相關蛋白對HBV-ACLF患者預后的預測價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2018年9月～2020年9月我院收治的HBV-ACLF患者60例，男36例，女24例；年齡31～58歲，平均年齡為(43.7±4.7)歲。ACLF診斷符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》的診斷標準[11]，有乙型肝炎病史。排除標準：有飲酒習慣(女性大于20 g/d，男性大于40 g/d)，酒精性肝炎或其他病因導致的ACLF、合并甲狀腺功能改變性疾病、合并惡性腫瘤、近2個月內應用過免疫抑制劑者。另選擇同期健康人65例作為對照，男35例，女30例；年齡30～62歲，平均年齡為(44.9±5.4)歲。兩組性別和年齡比較無顯著性差異(P>0.05)。納入的所有HBV-ACLF患者簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會審核。

1.2 血清指標檢測 采集靜脈血3 mL，3000 r/m離心10 min，分離血清。采用ELISA法檢測血清p62、LC3-Ⅱ和Beclin1水平(優尼康公司試劑，美國Bio-Rad公司生產的680型全自動酶標儀)；使用日本佳能TBA-FX8型全自動生化分析儀及其配套試劑盒檢測血生化指標；采用熒光定量聚合酶鏈反應法測定血清HBV DNA(試劑盒購自貝克曼庫爾特有限公司)。終末期肝病模型評分(model for end-stage liver disease，MELD)=3.78×ln[TBIL(mg/dl)]+11.2×ln[INR]+9.57×ln[sCr(mg/dl)]+6.43。

1.3 治療方法 所有HBV-ACLF患者均接受內科綜合治療，包括抗病毒、護肝、退黃、促肝細胞再生、調節免疫功能等，并根據病情間斷給予血漿置換或血液濾過支持治療，必要時進行血漿置換聯合血液濾過或雙重血漿分子吸附系統聯合血液濾過治療。

2 結果

2.1 兩組血清HBV DNA和肝功能指標比較 60例HBV-ACLF患者血清TBIL、ALB和INR水平顯著異常(表1)。

表1 兩組血清HBV DNA和肝功能指標比較

2.2 兩組血清自噬相關蛋白水平比較 HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ和Beclin1水平顯著高于健康人，而血清p62水平顯著低于健康人(P<0.05，表2)。

表2 兩組血清自噬相關蛋白水平比較

2.3 不同疾病轉歸的HBV-ACLF患者血清自噬相關蛋白水平和MELD評分比較 本組患者在治療觀察的90 d，死亡18例(30.0%)；入院時，死亡的HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ、Beclin1水平和MELD評分均顯著高于生存組，而血清p62水平顯著低于生存組(P<0.05，表3)。

表3 不同轉歸的HBV-ACLF患者血清自噬相關蛋白和MELD評分比較

2.4 MELD和血清自噬相關蛋白聯合預測HBV-ACLF患者預后的效能分析 以MELD評分>18.3 分為截斷點預測HBV-ACLF患者不良預后的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.917，約登指數為0.758，其敏感度為93.7%，特異性為82.1%；以血清p62<2.2 ng/mL為截斷點，預測HBV-ACLF患者不良預后的AUC為0.856，約登指數為0.485，其敏感度為85.2%，特異性為63.3%；以血清LC3-Ⅱ>70.3 ng/mL為截斷點預測HBV-ACLF患者不良預后的AUC為0.820，約登指數為0.588，其敏感度為80.0%，特異性為78.8%；以血清Beclin1>12.6 ng/mL為截斷點預測HBV-ACLF患者不良預后的AUC為0.765，約登指數為0.399，其敏感度為79.6%，特異性為60.3%；應用三者聯合預測HBV-ACLF患者死亡的AUC為0.910，其敏感度為95.2%，特異性為80.0%，預測價值顯著優于任何一個單因素預測(Z=2.998、Z=3.025、Z=3.548，P<0.05，圖1)。

圖1 MELD評分和血清自噬相關蛋白聯合預測HBV-ACLF患者預后的ROC曲線分析

3 討論

肝臟疾病的最終預后取決于多種因素，但目前針對失代償期肝硬化和肝衰竭患者的治療還存在諸多問題[12，13]。因此，如何有效控制肝病的發展、準確評估療效、預測預后，對于肝衰竭患者選擇合適的治療方法和時機非常重要。目前，自噬在疾病發病過程中的作用是研究的熱點之一。自噬在細胞的生長發育和生物學功能發揮方面起著維穩的功能。然而，當細胞的損傷超過了細胞自身的修復能力時，將啟動吞噬死亡[14]。為了進一步探討自噬在HBV-ACLF發病過程中的作用，為臨床干預治療提供依據，本研究對比分析了不同預后的HBV-ACLF患者血清自噬相關蛋白水平的變化差異。

LC3是一個位于自噬雙膜上的自噬相關蛋白，編碼LC3的基因與Atg8是同源的，主要參與自噬的延展，在細胞內以LC3-I和LC3-Ⅱ的形式存在。在機體自噬激活時，LC3-I通過泛素化修飾，與磷脂酰乙醇胺聚合而延長雙層膜，最終形成LC3-Ⅱ型。LC3-Ⅱ可被用于標志自噬水平；Beclin 1是在自噬過程中在哺乳動物體內最早發現的腫瘤抑癌基因之一，通過與多種輔因子相結合調節Vps-34活性，形成Beclinl-Vps34-Vpsl5復合體，誘導自噬的啟動[15，16]。本研究中，HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ和Beclin 1顯著高于健康人，說明HBV-ACLF患者體內自噬水平出現異常，究其原因可能是細胞內環境在慢性炎癥疾病的影響下發生改變，而HBV DNA載量增多也會提升細胞自噬水平，這一結論在一些研究[17]中也得到了證實；p62蛋白作為自噬降解底物，一般與LC3-Ⅱ和泛素化蛋白質聚合，其C端和N端分別結合泛素化蛋白LC3-Ⅱ，集成到自噬吞噬體中，然后在自噬溶酶體降解，其水平與自噬功能成反比[18，19]。本研究中，HBV-ACLF患者血清p62顯著低于健康人，與HBV-ACLF患者肝功能下降和肝組織改變導致自噬激活有關。所以，HBV-ACLF患者細胞自噬水平增強。本研究發現死亡組HBV-ACLF患者入院時MELD評分顯著高于生存組，MELD評分系統在終末期肝病患者的預后評估中優勢明顯[20，21]。值得關注的是，死亡的HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ水平顯著高于生存組，血清p62水平顯著低于生存組，提示自噬相關蛋白與HBV-ACLF患者預后有一定的關聯。HBV-ACLF患者自噬被激活，隨著肝功能的減退，自噬相關蛋白水平發生了顯著的改變。自噬相關蛋白誘導細胞對于損傷細胞器和蛋白的降解能力顯著提升，與疾病的預后關系密切。

本研究應用ROC曲線評估三種自噬蛋白對患者預后的預測價值，發現以血清p62<2.2 ng/mL為截斷點預測HBV-ACLF預后不良的AUC為0.856；分別以LC3-Ⅱ>70.3 ng/mL和Beclin1>12.6 ng/mL為截斷點預測HBV-ACLF預后不良的AUC為0.820和0.765，三者聯合預測HBV-ACLF預后不良的AUC為0.910，顯著優于三者單獨預測，與MELD評分的預測價值相近，提示三者聯合對HBV-ACLF患者預后的預測價值較高。今后在臨床治療中，可以對HBV-ACLF患者自噬相關蛋白水平進行動態檢測和分析，進一步研究其變化規律和影響因素，有望成為預測HBV-ACLF患者預后的新的標志物。但本研究病例來自同一醫院、隨訪時間較短，研究結果可能存在一定的偏差，有待擴大樣本量進行多中心和前瞻性的研究，進一步探究HBV-ACLF患者血清p62、Beclin1和LC3-Ⅱ水平檢測的臨床意義。

綜上所述，本研究60例HBV-ACLF患者血清自噬相關蛋白水平顯著不同于正常人，應用三者聯合可為HBV-ACLF患者的預后評估提供更為準確的預測方法。