肝內(nèi)膽管癌患者血清CXCL9和IFN-γ水平變化及其臨床意義探討

宋 雪，席子涵，李 婷，周 苗

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是原發(fā)性肝癌中較為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。目前，ICC的發(fā)病因素尚未完全闡明，但學(xué)者們認(rèn)為其發(fā)病與寄生蟲感染、肝內(nèi)膽管結(jié)石、病毒性肝炎、血管生成和免疫調(diào)節(jié)紊亂等有關(guān)。此外，臨床仍缺乏有效評(píng)估ICC患者預(yù)后的指標(biāo)[2-4]。因此，尋找與ICC發(fā)病有關(guān)且可有助于評(píng)估患者預(yù)后的標(biāo)志物是關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌趨化因子配體9(C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9)表達(dá)失調(diào)，可能通過抑制T細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)病進(jìn)程[5]。另外，干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)在肺腺癌患者中表達(dá)下調(diào)，也可能在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[6]。本研究檢測(cè)了ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平變化，并分析了檢測(cè)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年1月～2017年1月我院收治的ICC患者63例，男40例，女23例；年齡為36～75歲，平均年齡為(58.66±12.36)歲。參考《美國肝膽胰學(xué)會(huì)共識(shí)聲明》[7]有關(guān)ICC判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診；(2)術(shù)前未進(jìn)行過放化療等任何抗腫瘤治療。腫瘤<5 cm者20例，腫瘤≥5 cm者43例；TNM Ⅰ/Ⅱ期者47例，Ⅲ/Ⅳ期者16例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例；低分化者30例，中/高分化者33例；脈管癌栓11例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肝、腎功能不全、其他惡性腫瘤；(2)失訪者。另選擇同期在我院健康體檢者63例，男38例，女25例；年齡為35～77歲，平均年齡為(59.02±12.54)歲。ICC組與健康人男女性別比例和年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象或其家屬簽署知情同意書，本研究符合《赫爾辛基宣言》，并獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 63例ICC患者均接受根治性腫瘤切除術(shù)，并清掃周圍淋巴結(jié)。

1.3 血清CXCL9和IFN-γ水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：CSB-E11718h-1和江蘇普諾生生物科技有限公司，貨號(hào)：PK-EL-61806)，于冰箱中取出試劑盒內(nèi)配套的標(biāo)準(zhǔn)品，配制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測(cè)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。將血清解凍，平衡至室溫，將血清加入酶標(biāo)板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔100μL；將酶標(biāo)板放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育20～30 min，每孔分別加入相應(yīng)含有CXCL9 生物素工作液100 μL或IFN-γ生物素工作液100 μL，37℃孵育50～60 min，棄掉反應(yīng)液，用PBS洗滌2次；每孔加親和素-過氧化物酶復(fù)合物工作液100 μL，37℃孵育30 min，棄去反應(yīng)液，用PBS洗滌3次；每孔添加顯色液90 μL，37℃孵育20 min，每孔加入終止液10 μL，于Q3000型酶標(biāo)儀(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)450 nm處檢測(cè)各樣本吸光度值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線計(jì)算血清CXCL9和IFN-γ水平。

1.4隨訪 采取電話/門診隨訪，以ICC患者接受手術(shù)日期為隨訪起點(diǎn)，以死亡或隨訪截止至2020年1月為隨訪終點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清CXCL9和IFN-γ水平比較 與健康人比，ICC患者血清CXCL9水平顯著升高(P<0.05)，而血清IFN-γ水平顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 兩組血清CXCL9和IFN-γ水平比較

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平比較 不同TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同分化程度的ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平差異顯著(P<0.05)，而不同性別、年齡、腫瘤大小、有無脈管癌栓的ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平無顯著性差異(P>0.05，表2)。

表2 不同臨床和病理學(xué)特征ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平比較

2.3 不同血清CXCL9和IFN-γ水平的ICC患者預(yù)后比較 對(duì)63例ICC患者進(jìn)行36個(gè)月的隨訪，結(jié)果死亡42例(66.7%)，生存21例(33.3%)；以ICC患者血清CXCL9水平為820.7 pg/mL為截?cái)帱c(diǎn)，低水平者30例，高水平者33例，經(jīng)Kaplan-Meier生存分析顯示，血清CXCL9低水平的ICC患者術(shù)后36個(gè)月生存16例(53.3%)，顯著高于CXCL9高水平組的5例(15.2%)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組生存率比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=12.448，P<0.001)；以ICC患者血清IFN-γ水平為18.7 ng/L為截?cái)帱c(diǎn)，低水平者34例，高水平者29例，IFN-γ低水平組術(shù)后36個(gè)月生存5例(14.7%)，顯著低于高水平組的16例(55.2%)，兩組生存率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=10.554，P=0.001)。

3 討論

ICC是一種消化道惡性腫瘤，其起病隱匿，早期易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)放化療敏感性低，多數(shù)患者治療預(yù)后極差，對(duì)人類健康構(gòu)成極大的威脅[8-10]。因此，尋找ICC發(fā)病相關(guān)因素，并及早干預(yù)，對(duì)改善患者預(yù)后有一定的積極意義。

趨化因子是一類蛋白多肽小分子，包含CC、C、C3XC4、CXC等4個(gè)亞族。CXC類趨化因子在腫瘤發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用，包括調(diào)控腫瘤有關(guān)血管生成、白細(xì)胞浸潤、刺激宿主對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答、以旁分泌/自分泌方式影響腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等[11，12]。CXCL9屬于趨化因子CXC亞族，其基因位于4q21染色體上，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡，介導(dǎo)血管穩(wěn)定，影響免疫調(diào)節(jié)，與結(jié)直腸癌、胃癌、ICC等癌癥發(fā)展過程相關(guān)[13-15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CXCL9在早期乳腺癌發(fā)病過程中水平異常升高，其與乳腺癌患者不良預(yù)后及腫瘤浸潤有關(guān)，CXCL9可作為判定乳腺癌患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[16]。另外，CXCL9在胰腺癌中呈高表達(dá)，其可能與其參與趨化免疫細(xì)胞作用，與患者不良預(yù)后相關(guān)，有望成為治療胰腺癌的潛在靶標(biāo)[17]。以上研究證實(shí)，CXCL9水平異常可能與多種腫瘤的病變過程密切相關(guān)。Fukuda et al[18]研究認(rèn)為CXCL9可能通過調(diào)節(jié)ICC腫瘤浸潤性自然殺傷細(xì)胞，進(jìn)而影響患者預(yù)后，因此認(rèn)為CXCL9可作為評(píng)估ICC患者預(yù)后及治療ICC的生物學(xué)靶點(diǎn)。在本研究中ICC組患者血清CXCL9水平顯著高于健康組，與其在胰腺癌中的表現(xiàn)趨勢(shì)一致[16]，提示CXCL9可能在ICC發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用，推測(cè)CXCL9作為趨化因子家族成員之一，其水平升高可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤、細(xì)胞增殖，影響機(jī)體免疫應(yīng)答或血管生成等，進(jìn)而促進(jìn)ICC的發(fā)展，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究證實(shí)。

IFN-γ主要是由自然殺傷細(xì)胞和活化的T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，人IFN-γ基因位于第12號(hào)染色體，其可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成，影響腫瘤微環(huán)境，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。另外，IFN-γ可通過增加巨噬細(xì)胞膜表面Fc受體表達(dá)水平，進(jìn)而增加巨噬細(xì)胞因子合成抑制因子，從而抑制活化的Th1淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和白細(xì)胞介素-2，抑制免疫應(yīng)答，與多種腫瘤病理學(xué)發(fā)展關(guān)系密切[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在胃癌患者血清中水平降低，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)，其可能參與并影響胃癌病理學(xué)發(fā)展結(jié)局[22，23]。在本研究中ICC患者血清IFN-γ水平顯著低于健康人，提示IFN-γ可能在ICC發(fā)病過程中起重要作用，究其原因，一方面，低水平的IFN-γ降低了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成的抑制作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用降低，進(jìn)而促進(jìn)ICC發(fā)生和發(fā)展；另一方面，Th1型細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2型細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫，且機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫調(diào)節(jié)以Th1型細(xì)胞為主。若發(fā)生免疫功能偏移，形成Th2型細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞易發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，故低水平IFN-γ抑制自然殺傷細(xì)胞分泌IFN-γ，降低自然殺傷細(xì)胞的殺傷性，不利于Th1細(xì)胞分化，反而能促進(jìn)Th2型細(xì)胞形成，影響免疫平衡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)ICC病理學(xué)生長(zhǎng)和發(fā)展，但仍需進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

在本研究中ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度相關(guān)，進(jìn)一步提示CXCL9和IFN-γ與ICC患者臨床和病理學(xué)特征有關(guān)，兩者均可能在ICC發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本研究顯示，CXCL9低水平組和IFN-γ高水平組ICC患者術(shù)后36個(gè)月生存率分別顯著高于CXCL9高水平組或IFN-γ低水平組，提示ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平異常變化與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，兩者有望成為評(píng)估ICC預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上所述，ICC患者血清CXCL9水平顯著上調(diào)，而血清IFN-γ水平顯著降低，兩者均可能參與并影響ICC患者發(fā)病的進(jìn)展，檢測(cè)血清CXCL9和IFN-γ水平有利于臨床評(píng)估ICC患者預(yù)后情況。但本研究未深入探究CXCL9和IFN-γ在ICC患者的變化規(guī)律，且樣本較少，易造成檢測(cè)誤差，后期將擴(kuò)大研究樣本量進(jìn)行深入研究。