DCE-MRI定量參數聯合循環腫瘤細胞對預測食管鱗癌病理分級的價值

邢文群，路雙，張宏凱，賈爭艷，秦建軍，曲金榮

食管癌由于早期癥狀不明顯，確診時大部分患者已發展為中晚期食管癌，治療效果較差，目前手術切除仍然是局部食管癌治療的金標準[1]。以往研究發現，食管癌的分化程度是其生存及預后的獨立危險因素，食管癌的分化程度又可以反映其生物學行為之間的差異[2,3]，因此術前對食管癌病理分級進行預測，可有效指導患者的臨床治療及反映其生物學行為。動態對比增強MRI(Dynamic contrast-enhanced MRI,DCE-MRI)通過使用對比劑可以可視化血管完整性，從而監測組織中的腫瘤變化[4,5]，惡性腫瘤由于血管生成迅速，因此比正常血管具有更高的滲透性。對比劑被注入血管時，會從毛細血管漏入組織，在組織內暫時改變T1弛豫時間。這些DCE-MRI定量參數來自于信號強度-時間曲線，相對容易計算[6]。魯亞南等[7]研究發現，食管癌DCE-MRI定量參數與食管癌病理分級呈正相關。外周循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)反映腫瘤細胞從癌灶逃逸通過血液循環[8]，相關文獻研究證實，CTCs為食管癌預后不良的獨立危險因素[9-11]，前期研究發現ADC值聯合CTCs可以很好地預測食管癌的病理分級[12]。文獻研究已經證實食管癌DCE-MRI定量參數和CTCs值可以在一定程度上反映食管癌病理分級[13,14]，但是關于食管癌DCE-MRI定量參數及循環腫瘤細胞與食管癌病理分級之間的關系尚未明確。本研究旨在探討食管癌MRI定量參數DCE-MRI和CTCs與食管癌病理分級之間的相關性，并分析有效參數對低分化食管鱗癌的診斷效能。

材料與方法

1.病例資料

搜集2016年10月-2018年10月在本院就診且符合納入及排除標準的患者。病例納入標準：①經活檢病理確診為食管癌；②入院前未進行任何抗腫瘤治療；③均進行食管MRI檢查及臨床CTCs探測，且在上述檢查后兩周內行食管癌根治術。病例排除標準：①活檢病理為非食管鱗癌；②食管癌的MRI圖像質量較差，影響疾病診斷及臨床要求；③勾畫食管癌病變最大層面ROI總面積<10 mm2。④食管、胃交界處病變或存在食管占位以外其他惡性病變。本研究共搜集75例患者，排除6例非食管鱗癌、5例圖像質量差和2例病變最大層面較小難以勾畫ROI者，最終納入62例食管鱗癌患者。本研究通過河南省腫瘤醫院倫理委員會批準(2015ct068)，檢查前告知患者簽署知情同意書。

2.檢查方法

MRI檢查采用Siemens 3.0T MR掃描儀(MAGNETOM Skyra，Siemens Healthcare,Erlangen,Germany)，18通道體部線圈和內置32通道的脊柱線圈。患者禁食6 h，掃描前15～20 min肌注鹽酸消旋山莨菪堿注射液，以此來緩解食管蠕動，確認患者無青光眼、幽門梗阻、尿潴留、前列腺肥大等鹽酸消旋山莨菪堿注射相關禁忌癥[15]，且簽署用藥風險的知情同意書。掃描前患者常規訓練呼吸，取仰臥位，足先進。常規掃描屏氣T2WI冠狀面、矢狀面及T2抑脂序列，確定病變具體位置后，小范圍針對病變進行膈肌導航的應用刀鋒采集技術的快速自旋回波T2WI(T2-TSE-BLADE )掃描。自由呼吸放射狀K空間填充方式的容積內插體部檢查(radial volumetric interpolated breath-hold examination，Radial VIBE)序列開始掃描20 s后注入對比劑Gd-DTPA，針對病變位置，垂直于食管掃描。常規掃描MRI序列及掃描參數：T2WI抑脂序列，層厚5 mm，TR 6315.45 ms，TE 96.00 ms，矩陣226×384，視野264 mm×384 mm；屏氣T1WI正反相位，層厚3 mm，TR 2.72 ms，TE 0.95 ms，矩陣224×384，視野264 mm×384 mm；T2-TSE-BLADE序列，層厚3 mm，TR 5602.02 ms，TE 97.00 ms,矩陣256×256，視野240 mm×240 mm；擴散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)序列，層厚5 mm，TR 4000.00 ms，TE 54.00 ms，矩陣88×128，視野261 mm×380 mm，b值分別為50、700 s/mm2。DCE-MRI檢查采用Radial VIBE序列，層厚 2.5 mm,TR 3.87 ms，TE 1.78 ms，翻轉角12°，矩陣288×288，視野380 mm×380 mm。

3.圖像處理及分析

由兩位具有6年及16年食管磁共振診斷經驗的醫師對MRI圖像質量進行評分：1分代表MRI圖像具有明顯的偽影，不能區分食管壁各層結構；2分代表MRI圖像具有中度偽影，不能準確分辨出食管壁各層結構；3分代表MRI圖像有輕度偽影，基本可評估食管壁各層結構；4分表示MRI圖像好，沒有偽影，可分辨出食管壁各層結構；5分為MRI圖像非常好，沒有偽影，可清晰分辨出食管壁各層結構[16]。將DCE-MRI圖像導入GE Omni-Kinetics軟件(GE Medical，China)，選擇明顯的胸主動脈替代食管動脈獲取動脈輸入功能(arterial input function，AIF)。利用Tofts模型得到DCE-MRI藥代動力學參數，包括容量轉移常數(volume transfer constant，Ktrans)、速率常數(rate constant，Kep)、血管外細胞外間隙容積比(extravascular extracellular volume fraction，Ve)、血漿分數(plasma volume fraction，Vp)、對比劑最大濃度值(max concentration，MAX Conc)、時間信號曲線最大斜率值(MAX Slope)、增強后時間信號曲線下面積(area under curve,AUC )(圖1)。

圖1 胸中段低分化食管鱗癌患者，男，48歲，a～c圖中的暖色區域強化部分為腫瘤所在位置。a)Ktrans參數圖；b)Kep參數圖；c)Ve參數圖；d)橫軸面MRI增強圖像。

4.循環腫瘤細胞分離和富集

入組患者術前空腹采集5mL靜脈血，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中(4℃)。CTCs的分離和富集采用CanPatrol TM CTCs (SurExam,廣州,中國)二代技術聯合RNA原位雜交(RNA-ISH)[13]。RNA-ISH是在分支DNA(bDNA)的基礎上使CTCs呈現不同的表型。分支DNA主要是運用雞尾酒法在42℃，20 min運用于信號的擴增。標記出上皮細胞(EpCAM和CK8/18/19)和間質細胞(vimentin和TWIST1)的特異性標志物，將CTCs分為上皮型(E+，僅上皮型探針陽性，表示為僅紅色熒光信號)、混合型(E+/M+，上皮型探針和間質型探針均表現陽性，表示為同時出現紅色和綠色熒光)、間質型(M+，間質型探針陽性，表示為僅出現綠色熒光)[17,18](圖2)。

5.病理結果分析

病理結果由兩位具有5年以上診斷經驗的病理科醫師共同閱片，并按照WHO食管癌病理分級結果進行分級，將食管鱗癌分為高分化(G1)、中分化(G2)、低分化(G3)，相關文獻證實低分化食管鱗癌患者的預后及其生存期均較中分化及高分化患者差[19]。

6.統計學分析

采用SPSS 21.0、MedCalc 18.11和GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc,San Diego,CA)軟件進行統計學分析。采用Bland-Altman分析兩位磁共振診斷醫師所得DCE-MRI參數值的一致性，計算其組內相關系數(intraclass correlation coefficient，ICC)，ICC>0.75被認為一致性較好。采用Spearman秩相關分析比較病理分級與DCE-MRI參數值、CTCs值的相關性及兩者之間的相關性;r值為0.00～0.30表示兩者之間無相關性，r值為0.30～0.50表示相關性較低，r值為0.50～0.70表示具有中度相關性，r值>0.70表示具有較好的相關性[20]。采用Kruskal-WallisH檢驗及單因素方差分析比較不同病理分級間DCE-MRI參數值、CTCs總數及各亞型數目的差異。采用受試者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲線評價DCE-MRI參數值、CTCs總數及其各亞型數目對低分化食管鱗癌的診斷及預測能力，采用Z檢驗比較有效參數的AUC。以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1.患者臨床資料

62例食管鱗癌患者均直接進行食管癌根治術，其中男47例，女15例，年齡38～77歲，平均(61.24±8.51)歲。術后大病理提示，高分化食管鱗癌5例，中分化38例，低分化19例。

2.DCE-MRI定量參數在不同病理分級組間的差異

2位放射科診斷醫師分別對DCE-MRI圖像進行質量評分，圖像質量評分一致性較好(表1)。2位磁共振診斷醫師所得DCE-MRI定量參數的組內相關性較好，所得ICC為0.875。

表1 食管鱗癌DCE-MRI圖像質量的評分結果

CTCs總數、M+ CTCs及DCE-MRI定量參數與食管鱗癌病理分級均呈正相關(P值均<0.05)，DCE-MRI各參數間與CTCs及其亞型之間的相關性r<0.4，相關性差，但不是耦合關系，不會相互影響其對于食管癌病理分級的預測(圖3)。不同病理分級間的CTCs總數及間質型CTCs差異具有統計學意義(P<0.05)；DCE-MRI參數中Ktrans、Kep、VP、AUC及Max Slope在不同病理分級間差異有統計學意義(P<0.05)，但Ve在食管鱗癌不同病理分級間差異無統計學意義(P>0.05)(表2、3)。G1組間質型、混合型及CTCs總數低于G3組，差異具有統計學意義(P<0.05)；G3組與G2組的CTCs及其亞型之間差異無統計學意義；G1與G2組的E+ CTCs、M+ CTCs、CTCs總數差異具有統計學意義(P<0.05)。G3組的Ktrans、Kep、Vp、Max Conc、AUC、Max Slope均高于G2組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，但是在G1與G2組之間各參數差異無統計學意義(P>0.05)；G1組Ktrans、Kep及Max Conc低于G3組，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 DCE-MRI和CTCs及其亞型之間相關性熱圖，r值均<0.4，兩者相關性差。 圖4 ROC曲線顯示DCE-MRI有效參數及間質型CTCs聯合因素的AUC高于Ktrans 、間質型CTCs的AUC。

表3 不同病理分級間食管鱗癌CTCs的組間差異性分析

表2 不同病理分級間食管鱗癌DCE-MRI定量參數的組間差異性分析

3.DCE-MRI定量參數及CTCs診斷低分化食管鱗癌效能

DCE-MRI參數診斷低分化食管鱗癌的ROC曲線分析結果顯示，Ktrans(AUC=0.820，P<0.001)、Kep(AUC=0.744，P<0.001)、Vp(AUC=0.745，P<0.001)、Max Conc(AUC=0.718，P<0.001)、AUC(AUC=0.711，P=0.006)、Max Slope(AUC=0.695，P=0.004)中Ktrans的診斷效能最佳。通過分析CTCs總數及其亞型診斷低分化食管鱗癌的ROC曲線，可知M+ CTCs(AUC=0.673，P<0.05)對于診斷低分化食管鱗癌有一定價值，CTCs總數診斷低分化食管鱗癌的效能較差(P>0.05)。采用二元logistic回歸分析聯合DCE-MRI有效因素(Ktrans、Kep、Vp、Max Conc、AUC、Max Slope)及間質型CTCs診斷低分化食管鱗癌的效能(AUC=0.913，P<0.001)，診斷敏感度和特異度分別為86.0%、84.2%，優于任意單一因素的診斷效能(表4、5，圖4)。聯合因子計算公式如下：聯合因子=Marker1+ Marker2*Marker2B值/Marker1B值+……Marker n*Marker nB值/Marker1B值。

表4 食管鱗癌DCE-MRI參數、CTCs及有效參數聯合因素對低分化食管鱗癌的診斷效能

表5 食管鱗癌DCE-MRI定量有效參數及M+ CTCs單一因素的診斷效能

討 論

1.DCE-MRI定量參數及CTCs對不同病理分級的診斷價值

本研究結果顯示DCE-MRI定量參數及CTCs與食管鱗癌病理分級呈正相關，腫瘤分化程度越低，惡性程度越高，其值越高，且組間差異具有統計學意義；術前DCE-MRI定量有效參數聯合間質型CTCs可以有效預測食管鱗癌的病理分級。

獲取動態增強磁共振圖像時，將示蹤劑或對比劑注入血管，隨著對比劑濃度的改變，測量的目標組織的磁共振信號強度也隨之改變。因此，DCE-MRI定量參數可提供組織內部解剖及功能信息[21-26]。DCE-MRI除了提供解剖功能之外還能描述器官功能，因此在灌注相關研究中得到了廣泛應用[24]。DCE-MRI可通過定量參數反映腫瘤微環境的灌注和血管的通透性。本研究結果顯示，低分化食管鱗癌的Ktrans、Kep、Vp、Max Conc、AUC、Max Slope均高于中分化食管鱗癌，差異具有統計學意義。因此DCE-MRI定量參數可以反映腫瘤的血流灌注情況，這和以往的研究結果一致[27],原因可能為腫瘤的分化程度越低，惡性程度越高，腫瘤新生血管越多，但腫瘤新生血管內皮不完整，且血管基底膜通過物質速率增加[28]，因此對比劑進入血管間隙的總量和速率增加，Ktrans值升高；Kep表明該物質從細胞外和血管外空間(extravascular extracellular space，EES)返回血漿的速度，惡性程度高的腫瘤Kep升高[29];這與李琳琳等[14]的研究結果一致，其認為Ktrans、Kep可以有效反映食管鱗癌的病理分級；魯亞南等[7]認為，DCE-MRI定量參數Ktrans、Kep與食管癌病理分級相關，分化程度越低，其值越高，且其預測低分化食管鱗癌的AUC分別達0.941和0.809，但本研究中Ve值不能反映食管鱗癌的病理分級，與其研究結論不同，原因可能為Ve代表血管外細胞外間隙容積比，其不僅受血管外空間的影響，血流速度也會影響Ve的結果，因此我們可以將結果的不一致性歸因于Ve的復雜性[30]。惡性腫瘤異常血管的增多伴隨著物質轉運速率的增加，腫瘤內血管外的對比劑濃度最大值Max Conc隨之增大；對比劑濃度增大，惡性腫瘤增強后達峰時間就會縮短，相應增強后的時間信號曲線下面積(AUC)及時間信號曲線最大斜率值Max Slope增大，這和羅紅兵等[28]在乳腺癌中的研究結果一致。

CTCs以單細胞或團簇形式從腫瘤組織逃逸進入循環系統[31]。相關研究證實CTCs可以預測食管鱗癌放療的效率和預后，在腫瘤復發和治療反應評估中發揮重要作用[32]。本研究結果顯示M+ CTCs和CTCs總數與食管鱗癌病理分級呈正相關，中/低分化組食管鱗癌的CTCs高于高分化組，腫瘤分化程度低，惡性程度高，CTCs值越高，其存在轉移的可能性越大，生存及預后越差,與劉濤等[33]的研究結論一致，即上皮型CTCs及混合型CTCs與食管鱗癌病理分級、T分期及N分期顯著相關，且差異具有統計學意義。吳波等[34]也研究發現，CTCs與食管癌病理分級顯著相關，食管癌分化程度影響循環腫瘤細胞的陽性與否。趙振坤等[35]研究發現，卵巢癌患者循環腫瘤細胞的陽性與否與腫瘤病理分級密切相關。因此探測CTCs的數目及檢測其變化值，可以在腫瘤發生遠處轉移前及早觀測到微轉移，調整治療方案，以改善患者的預后。

2.DCE-MRI定量參數及CTCs對低分化食管鱗癌的診斷效能

本研究結果顯示，腫瘤Ktrans>1.621/min時，其診斷低分化食管鱗癌的效能優于M+ CTCs,由此可見食管DCE-MRI定量參數可以在分子水平上更早地顯示腫瘤組織的超微結果，且優于臨床CTCs效能。本研究結果顯示,聯合DCE-MRI有效參數+間質型CTCs診斷低分化食管鱗癌的效能優于單一因素的診斷效能。王準等[36]也研究發現聯合食管癌DWI及Sirtuin1(SIRT1)蛋白可以有效預測食管癌的輻射抵抗。將影像學檢查結果和臨床相關檢測結果相結合，可更早、更準確地預測腫瘤的病理分級。

本研究存在以下局限性：①本研究僅入組了食管鱗癌患者，未選擇其他類型食管惡性腫瘤，目前世界范圍內食管癌主要類型是食管鱗癌，我國主要病理類型為食管鱗癌，占全部食管癌患者的90%，因此本研究僅選擇食管鱗癌患者；②本研究通過胸主動脈獲取AIF，而沒有選擇食管動脈，是由于食管動脈太細，因此可能存在一定偏倚；③入組患者需同時具備DCE-MRI及CTCs資料，且均需進行食管癌根治術，因此本研究樣本量較少。

綜上所述，DCE-MRI定量參數、M+ CTCs與食管鱗癌的病理分級相關，且DCE-MRI定量參數值對低分化食管鱗癌的診斷效能優于M+ CTCs，兩者之間是獨立不相關的，聯合兩者有效因素診斷低分化食管鱗癌的效能優于任意單一因素。