宮頸癌患者癌組織中IL-33表達水平與臨床病理特征及預后的相關性

蘇博 閆振宇 郝尚輝 孫麗 忽平 高毅

南陽市中心醫院1病理科，3婦產科，4麻醉科（河南南陽473000）；2新鄉醫學院第一附屬醫院婦產科（河南新鄉453000）

2010-2013年，河北省宮頸癌粗發病率為14.62/10 萬例，死亡率為3.74/10 萬例，死亡率呈現下降趨勢，但發病率呈現上升趨勢［1］，國家癌癥中心研究數據顯示［2］，2015年中國宮頸癌新發患者高達近10 萬例，死亡患者3 萬例左右，宮頸癌已嚴重影響女性健康。盡管高危型人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持續性感染是導致宮頸癌發病的病理生理基礎，但僅僅部分患者可發展為宮頸癌［3］，單純從HPV 感染角度難以完全解釋宮頸癌的具體發病機制。白細胞介素-33（interleukin-33，IL-33）屬于內皮細胞分泌的一種細胞因子［4］，IL-33作為一種促炎因子參與了多種惡性腫瘤如卵巢癌［5］、子宮內膜癌［6］等發病機制，本課題組前期研究也證實IL-33 可作為宮頸癌的一項生物學標志物［7］，但目前關于宮頸癌組織中IL-33 的表達水平尚不清楚，本研究在前期研究的基礎上，進一步分析宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平與臨床病理特征及預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象納入2016年1月1日-2017年12月31日于南陽市中心醫院婦產科確診的184 例宮頸癌患者作為研究對象，年齡52 ～61 歲，平均（58.25±7.22）歲；腫瘤大小＜4 cm共83例，≥4 cm 共101 例；鱗癌共137 例，其他病理類型共47 例；腫瘤細胞中～高分化共61 例，低分化共123 例；肌層浸潤深度＜1/2 共56 例，肌層浸潤深度≥1/2 共128 例；FIGO 分期中Ⅰ期共63 例，Ⅱa 期共121 例；發生淋巴結轉移共104 例，未發生淋巴結轉移共80 例。納入標準：（1）宮頸癌診斷通過術后組織病理學診斷；（2）初次來我院就診并確診，宮頸癌為早期，FIGO 分期為Ⅰ～Ⅱa 期，且入院后采用廣泛子宮切除及盆腔淋巴結清掃術；（3）臨床資料完善。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤及宮頸癌遠處轉移等；（2）患有嚴重肝腎功能不全、血栓性疾病及其他不適合手術的疾病等；（3）合并其他自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、白塞病等；（4）術后失訪。所有患者術后每1 個月進行門診復診或電話隨訪，必要時進行影像學檢查，終止日期為患者復發、死亡日期或末次隨訪日期，本研究中末次隨訪截止日期為2020年12月31日，隨訪時間定義為手術后至復發、死亡時間或截止時間。宮頸癌患者術后復發或死亡定義為預后不良，其余定義為預后良好。本研究經過我院倫理委員會審核并批準。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑鼠源性IL-33 單克隆抗體購買于北京義翹神州科技股份有限公司（貨號：10368-HNAE，產地：中國）。SP免疫組化染色試劑盒及二抗（HRP標記羊抗鼠IgG）購買于上海碧云天生物試劑有限公司（上海，中國）。

1.2.2 宮頸組織中IL-33表達水平手術獲取宮頸癌患者癌組織和癌旁組織（距離癌組織3 cm 以上），癌組織和癌旁組織中IL-33 表達水平采用免疫組化法檢測。取我院病理科石蠟包埋的切片，連續切片后制成4 μm 厚度切片，常規進行脫蠟和水化，檸檬酸鈉緩沖液加熱進行抗原修復，3%過氧化氫溶液室溫孵育15 min 用于阻斷內源性過氧化物酶，再次采用PBS 洗滌3 次，每次3 min。10%山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗后4 ℃孵育過夜，復溫后PBS 洗滌3 次，每次3 min，滴加二抗室溫孵育30 min。切片用DAB 顯色，蘇木精復染。切片沖洗干燥后中性樹膠封片。以已知陽性反應片作為陽性對照，以PBS 作為一抗用于陰性對照。參考文獻［8］，免疫組化結果按照如下判定：IL-33 抗原陽性反應為細胞胞漿中出現黃色顆粒，與背景對比，無色、淺黃色、棕黃色和棕褐色分別得0 分、1 分、2 分和3 分；陽性細胞數得分：隨機采集10 個代表性的視野計算陽性表達率，陽性表達率為陽性細胞數/腫瘤細胞總數*100%，陽性表達率5%、5% ～25%、26% ～50%、51% ～75%及75%以上分別得分0 分、1 分、2 分、3 分和4 分。染色強度得分*陽性細胞數得分為0 ～1 分、2 ～3 分、4 ～5 分和≥6 分時分別計為陰性（-）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強陽性（+++），本研究中將“++～+++”視為高表達，將“-～+”視為低表達。

1.2.3 臨床病理資料的收集所有研究對象年齡、產次、腫瘤大小、組織學類型、分化程度、肌層浸潤深度、FIGO 分期、淋巴結轉移等。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布，以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用頻數或百分比表示，采用卡方檢驗，宮頸癌患者不良預后的危險因素采用Cox 風險比例模型分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達及分布本研究中宮頸癌患者癌旁組織中IL-33 均為低表達，癌組織中IL-33 高表達共126 例，低表達共58 例。IL-33 主要表達于細胞胞漿中，呈現棕黃色及棕褐色顆粒。結果見圖1。

圖1 宮頸癌組織中IL-33 表達情況（×200）Fig.1 IL-33 expression level cervical cancer tissues（×200）

2.2 宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平與臨床-病理特征的關系宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平在分化程度、肌層浸潤深度、FIGO 分期和淋巴結轉移上差異存在統計學意義（P＜0.05），而與年齡、產次、腫瘤大小及組織學類型無明顯相關性。結果見表1。

表1 宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平與臨床-病理特征的關系Tab.1 The relationship between the expression level of IL-33 and the clinical-pathological characteristics in cervical cancer tissues例

2.3 宮頸癌患者術后預后不良和癌組織中IL-33表達水平的關系本研究中隨訪時間為5 ～60 個月，中位隨訪時間為37.25 個月。截止到隨訪結束，本研究中宮頸癌患者復發或死亡共141 例，未復發或死亡43 例，其中復發或死亡患者癌組織中IL-33 高表達103 例，低表達38 例，未復發或死亡患者癌組織中IL-33 高表達23 例，低表達20 例，預后不良與預后良好組患者癌組織中IL-33 表達水平差異存在統計學意義（P=0.016）。

2.4 Cox 回歸分析Cox 回歸分析結果顯示，肌層浸潤深度、FIGO分期、淋巴結轉移和IL-33高表達是影響宮頸癌患者不良預后的危險因素（P＜0.001），見表2。

表2 宮頸癌患者不良預后的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of the poor prognosis of patients with cervical cancer

3 討論

宮頸癌嚴重影響女性的生殖健康，盡管宮頸細胞學篩查對檢測早期宮頸癌具有一定重要意義，但是仍無法抑制宮頸癌的發病風險［9］，隨著近年來分子生物學的發展，多項研究致力于探討宮頸癌的分子標志物［10］。IL-33 屬于一種炎癥介質，參與了多個生殖系統腫瘤的發病機制［5-6］，鑒于目前關于IL-33 和宮頸癌的相關性研究報道較少，本研究通過探討宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平及其臨床意義。

IL-33 屬于白細胞介素1（interleukin-1，IL1）家族成員之一，其編碼基因位于9 號染色體短臂上，IL-33 本質上屬于一種促炎因子，表達于多種類型細胞如上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞中［11-12］，IL-33 通過其受體ST2 可參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）等多種炎癥信號通路的調節［13-14］，而炎癥與腫瘤的發病機制密切相關［15］。ZHOU 等［16］發現，腫瘤相關成纖維細胞可分泌IL-33，IL-33 能通過其受體ST2 誘導上皮間質轉化的發生而促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，當IL-33 或ST2 基因沉默后可抑制這種現象的發生；此外，IL-33 能顯著提促進腫瘤細胞中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達和分泌［17］，VEGF 可受到M2型巨噬細胞的調控而參與腫瘤組織中新生血管的形成［18］。另一方面，IL-33 除了通過直接或間接促進腫瘤組織中的血管形成之外，也能通過作用于免疫細胞而影響腫瘤微環境，最終促進腫瘤的發生發展，JOVANOVIC 等［19］證實，當對乳腺癌小鼠模型中給予IL-33 后可抑制樹突狀細胞的成熟，促進免疫耐受并降低自然殺傷細胞的細胞毒性作用而促進腫瘤的生長和轉移。本課題組前期研究證實［7］，宮頸癌患者血清中IL-33 表達水平顯著升高，在臨床分期、腫瘤細胞分化程度上存在顯著差異，IL-33 單獨診斷宮頸癌敏感度和特異度均可達80%以上，本研究進一步通過免疫組化分析宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平發現，癌旁組織中IL-33 均為低表達，癌組織中IL-33 大多為高表達，且宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平在分化程度、肌層浸潤深度、FIGO 分期和淋巴結轉移上存在顯著差異（P＜0.05），這一結果與本研究前期結果基本相一致。目前關于IL-33 如何參與調控宮頸癌發病的具體分子生物學機制報道較少，HPV 持續性感染可導致宮頸癌的發生，但是具體機制不清楚，KULHAN 等［20］研究顯示，宮頸組織中HPV 的持續性感染可能會誘導IL-33 高表達，最終通過多種信號途徑促進宮頸癌的發生，此外，WANG 等［21］發現IL-33 也可誘導宮頸組織中IFN-γ表達上調而參與宮頸癌的發病機制。隨訪期間發現，宮頸癌組織中IL-33 高表達組復發或死亡風險顯著高于低表達組，提示IL-33 高表達與宮頸癌患者的不良預后有關，本研究同時發現，腫瘤細胞低分化、肌層浸潤深度越深、FIGO 分期越高和發生淋巴結轉移的宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平均顯著升高，腫瘤細胞分化程度越低，說明惡性程度越高，而肌層浸潤深度越深和發生淋巴結轉移，說明腫瘤細胞越容易進行局部侵襲和遠處轉移，FIGO 分期是綜合多種因素進行預后評估，通常FIGO 分期越高，預后越差，劉海鳳等［8］證實這些臨床因素均是宮頸癌患者不良預后的指標之一，本研究進一步通過Cox 回歸分析證實IL-33 高表達與宮頸癌患者不良預后有關。因此，筆者認為宮頸癌組織中IL-33 高表達與宮頸癌的發生發展密切相關，可作為評估宮頸癌預后的一種生物學標志物。

綜上所述，宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達水平顯著升高，與宮頸癌的臨床病理特征顯著相關，對宮頸癌的發生發展及預后有著極其重要的意義，IL-33 也可作為篩查宮頸癌的一種生物學標志物，然而，日后IL-33 如何調節宮頸癌的發病機制仍是下一步繼續研究的方向。