基于硝基咪唑衍生物的Cu(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)配合物的合成、晶體結構及生物活性

楊莉寧 劉春葉 成 昭 梁玲玲 張 劍

(西安醫學院藥學院，西安 710021)

咪唑作為許多酶的活性中心功能基團，參與了很多重要的生物化學反應，對生命活動起著十分重要的作用[1?3]。硝基咪唑類化合物與生物體內許多大分子如DNA、酶和受體等發生超分子結合[4]，產生廣泛的醫藥活性如抗病毒、抗結核、抗腫瘤、抗感染、抗寄生蟲等，因而備受人們的關注[5?7]。就其抗感染方面來說，硝基咪唑具有潛在的抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌活性，其中甲硝唑和替硝唑已被用于治療幽門螺旋桿菌引起的感染，顯示出硝基咪唑類化合物在研發新型抗菌藥領域的潛力。而甲硝唑作為最基本、最常見的硝基咪唑類藥物，由于在臨床上的長期使用，存在一定的耐藥性和不良反應，所以對甲硝唑進行結構修飾，增強其抗菌作用，減少不良反應，是近年來藥物化學領域的熱門課題[8?11]。

Cu是生命組織體內的微量元素。以有機酸和其它供體作為配體的Cu(Ⅱ)配合物廣泛存在于生物體內，并在化學和生物化學催化系統中起著很重要的作用[12]。在多種金屬蛋白(金屬酶)中，咪唑環中的氮原子是1個常見且很重要的鍵合點，如在藍色的銅蛋白中，都有一個或多個咪唑環鍵合到銅或其它金屬離子上，并因此對其生物活性造成極強的影響[13]。銀離子具有極強的廣譜抗菌、抑菌作用,同時對人體細胞具有較低的毒副作用。Nomiya曾發現咪唑銀配合物具有很強的抗菌能力[14]。

基于此，我們合成了硝基咪唑衍生物——N，N′?二甲基?5?硝基?2，2′?聯咪唑(L)(Scheme 1)，并以它為配體，得到了2種含過渡金屬Cu(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)的配合物，對配體及其配合物與小牛胸腺DNA(ct?DNA)的相互作用及其抗厭氧菌活性進行了初步研究。

Scheme 1 Structure of ligand L

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

ct?DNA、三羥甲基氨基甲烷((CH3OH)3CNH2，Tris)、BHI(腦心浸液)培養液或培養基、瓊脂粉均為生化試劑，其余均為分析純試劑，用前未做進一步處理。蒸餾水為二次蒸餾水。配體L按文獻方法合成[15?16]。

所用儀器有Vario EL?ⅢG型元素分析儀(德國EA元素分析系統公司)、6460A型三重串聯四極桿液質聯用儀(美國 Agilent科技有限公司)、EQUI?NOX55型紅外光譜儀(德國Brucker公司)、STA449C型熱分析儀(德國NETZCH公司)、1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)、Ubbeoldhe黏度計(上海申玻玻璃儀器廠)、DDS?307型電導儀(上海大譜儀器有限公司)、F?4500熒光分光光光度計(日本日立公司)、Bruker SMART CCD單晶衍射儀(德國Bruker公司)、YQX?Ⅱ厭氧培養箱(上海博泰實驗設備有限公司)、ELX 800TM酶標儀(美國Bio Tek公司)。

1.2 配合物的合成

[Cu(L)(Ac)2]2(1)：將 0.5 mmol Cu(Ac)2·H2O 和 0.5 mmol配體L分別溶于15 mL甲醇中，混合并攪拌1 h，過濾，濾液在室溫下放置，7 d以后有藍色晶體析出。元素分析按C24H30Cu2N10O12的計算值(%)：C 37.06，N 18.015，H 3.89；實驗值 (%)：C 37.05，N 17.81，H 3.65。

配合物[Ag(L)(NO3)]·H2O(2)：將 0.5 mmol AgNO3和0.5 mmol配體L分別溶于15 mL甲醇中，混合并攪拌2 h，過濾，得淡黃色粉末，避光保存。元素分析按 AgC8H11N6O6的計算值(%)：C 24.30，N 21.26，H 2.78；實驗值(%)：C 24.32，N 21.43，H 2.51。ESI?MS(乙腈為溶劑)：[Ag(L)]+m/z實測值(理論值)：315.19(315.019)。

1.3 配體及配合物與DNA相互作用實驗

采用文獻已報道的經典方法，對實驗所需試劑及緩沖溶液進行配制，并測定配體及配合物與DNA相互作用的紫外光譜、熒光光譜及黏度[17?18]。

1.3.1 配體及其配合物與ct?DNA相互作用的紫外光譜

室溫條件下，以Tris?HCl緩沖溶液作對照，測定時樣品池和空白池分別裝3 mL溶液(配體、配合物1和配合物2溶液濃度均為0.1 mmol·L-1)，在200～600 nm波長范圍掃描；依次加入濃度為80.7 μmol·L-1的DNA溶液0.02 mL(加5次)，每次加入DNA溶液后充分混合并作用5 min后再進行掃描。

1.3.2 配體及其配合物與ct?DNA相互作用的熒光光譜

室溫條件下，在熒光光度計的比色皿中加入2 mL Tris?HCl緩沖溶液和1 mL濃度為0.1 mmol·L-1的配體或配合物溶液，再依次加入0.02 mL濃度為80.7 μmol·L-1的 DNA 溶液(加 5 次)，每次加入 DNA溶液后充分混勻并作用5 min，在一定激發波長激發下，分別掃描300～570 nm波長范圍內的熒光發射光譜，激發狹縫和發射狹縫都設置為10 nm。

1.3.3 配體及其配合物與ct?DNA相互作用的黏度

將待測溶液的溫度恒定在(25±0.1)℃，固定DNA溶液的濃度為80.7 μmol·L-1，每次分別加入濃度為0.1 mmol·L-1的配體、配合物1和配合物2溶液0.02 mL(加4次)，用烏氏黏度計測定含不同濃度配體、配合物1和配合物2的DNA溶液的相對黏度(η)。溶液的相對黏度按η=(t-t0)/t0計算，式中t0是緩沖溶液流經毛細管所需的時間，t是DNA溶液(含濃度不等的配體或配合物)流經毛細管所需的時間。η0是未加配體或配合物時DNA溶液的相對黏度。以(η/η0)1/3對結合比率(ccompound/cDNA)作圖，可得到配體或配合物的濃度對DNA的黏度影響曲線。

1.4 配合物晶體結構的測定

挑選大小為0.64 mm×0.38 mm×0.19 mm的配合物1單晶樣品，置于Bruker Smart APEX CCD單晶衍射儀上，采用經石墨單色化的MoKα射線(λ=0.071 073 nm)為輻射源，在296(2)K下以φ?ω掃描方式收集配合物X射線單晶衍射強度數據。數據經SAINT程序還原并對所得數據進行Lp強度因子校正，并經SADBAS程序[19a]進行半經驗法吸收校正。對氫原子采用各向同性熱參數，并用理論加氫法得到氫原子位置。采用全矩陣最小二乘法修正所有非氫原子坐標及其各向異性熱參數。晶體結構采用SHELXL?97[19b]程序由直接法解出。有關晶體學數據見表1。

表1 配合物1的晶體結構參數Table 1 Crystal parameters of complex 1

CCDC：2036599，1。

1.5 配體及其配合物的體外抗厭氧菌活性實驗[20]

采用經典的2倍稀釋法藥物敏感試驗原理測定配體及其配合物的最小抑菌濃度(MIC)。所用菌株為變形鏈球菌(Streptococcus mutansUA159)、伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemATCC 29523)(由第四軍醫大學口腔醫院牙體實驗室提供)。取凍存的變形鏈球菌(S.mutans)和伴放線放線桿菌(A.a)分別劃線接種于培養基表面，進行厭氧培養。挑取培養36 h的S.mutans和培養48 h的A.a菌落各自接種于培養液，其中前者培養24 h，后者培養48 h，備用。用少量DMSO配制配體及其配合物的溶液作為待測抗菌劑，用無菌水對各種抗菌劑從1 280～0.625 mg·L-1進行2倍梯度稀釋。96孔板的每孔中分別加入上述各種濃度的待測抗菌劑溶液、細菌培養液和BHI培養液，用酶標儀進行OD值測定。取對照組(每孔以磷酸鹽緩沖鹽溶液代替待測抗菌劑溶液，其余同前)100 μL，進行10倍梯度稀釋，取100 μL稀釋的菌液鋪于BHI培養基表面，培養48 h，得到每孔中原細菌生存數(同時對3個復孔進行計數，取平均值)。再于厭氧箱中培養24 h。培養后，繼續測定OD值，得到MIC值。所有的試樣均平行測試3次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 配合物的性質表征

配合物2元素分析的實驗值與理論值基本相符，初步可以確定其可能組成。25℃下，測得配合物2(1 mmol·L-1)在乙醇中的摩爾電導率Λm*為27.42 S·cm2·mol-1，結果表明配合物2屬于非電解質[21]，硝酸根參與了配位。

以KBr壓片測定配體及其配合物的紅外光譜。與配體L相比較，形成各配合物后特征吸收峰發生的偏移主要表現在咪唑環上的振動吸收，其中νC=N伸縮振動和配體相比由1 530 cm-1向低波數(1 518～1 528 cm-1)發生了紅移且強度降低，這是N原子與金屬配位引起C=N核間電子密度降低造成的，說明金屬與咪唑環上的3位N發生了配位。配合物1中的醋酸根的Δν值(νas,COO-νs,COO)接近200 cm-1，與文獻報道[22]的醋酸根對稱橋聯配位模式的紅外吸收峰一致，說明醋酸根與2個Cu離子橋聯配位，晶體結構解析(見后文)也證明了這一結論。配合物2存在含氧酸根NO3-，在譜圖上表現為6條譜帶，分別為1 630、1 375、1 290 cm-1處的 νas,NO-3，1 100 cm-1處的，及 897和 870 cm-1處的 δNO-振動吸收，指紋區3譜帶增加，說明NO3-可能以單齒形式參與配位，配位后對稱性降低，使譜帶增多[23]。而位于指紋區的420 cm-1吸收峰可以歸因為配位鍵 νAg—N。

用Tris?HCl緩沖溶液配制配體L及其2種配合物(0.1 mmol·L-1)的溶液，測定它們的紫外可見吸收光譜(圖1)。圖1表明配體在200～400 nm范圍內有2個主要吸收峰，分別位于240和336 nm處，可分別歸屬為有機配體咪唑環共軛體系的π→π*和n→π*躍遷。2種配合物和配體呈現有類似的雙吸收峰，但吸收峰的強度發生了改變，同時配體的240 nm處的吸收峰在配合物中均發生了略微的藍移，這是金屬離子與配體發生配位的結果。

圖1 配體L和配合物1、2的UV?Vis光譜圖Fig.1 UV?Vis spectra of ligand L and complexes 1,2

在室溫條件下，分別測定了配體L和配合物2的固體熒光光譜(圖2)。在280 nm紫外光激發下，配體分別在471、485和493 nm處有弱的熒光發射峰，主要是配體內的π→π*躍遷所致。而配合物2在300 nm激發光激發下于421、452和468 nm處產生較強的藍光熒光發射光譜，相較于配體，其熒光發射峰發生了藍移，是由配體與金屬配位后配體的共軛程度降低而引起的[24]。

圖2 配體L和配合物2的固體熒光光譜Fig.2 Solid fluorescence spectra of ligand L and complex 2

在氮氣流速30 cm3·min-1、升溫速率20 ℃·min-1的條件下進行熱重分析，測得2種配合物從室溫到800或1 000℃溫度范圍內的熱重-示差掃描量熱(TG?DSC)曲線(圖 3)。

從圖3的TG曲線可以看出，配合物1的結構在200℃開始快速坍塌，失重率為41.35%，對應于配合物熔化并分解失去2個醋酸根及配體咪唑環上的硝基(理論值：42.21%)，同時DSC曲線上在226℃出現一個尖銳的吸熱峰，這與配合物的熔點一致。隨后直至接近1 000℃，配合物1緩慢失去剩余的二甲基聯咪唑殘片，最終的殘余物可能為Cu單質，殘余量15.67%，與理論值16.34%基本相符。

圖3 配合物1和2的TG?DSC曲線圖Fig.3 TG?DSC curves of complexes 1 and 2

配合物2的熱分解可以分為3步。在100～180℃為第一步的緩慢失去結晶水的過程，TG曲線平緩下降，失重率為4.66%(理論值：4.56%)，同時DSC曲線上對應在121℃出現一個很小的吸熱峰。DSC曲線在202℃有一尖銳的吸熱峰，可能是配合物熔化吸熱，同時TG曲線開始迅速下降，對應于配合物第2步分解，失去有機配體L，直到300℃左右，此時總失重實驗值為57.46%，與理論值56.96%相吻合。其后為第3步，殘余的AgNO3緩慢分解，失重趨勢變慢，從300～800℃殘余物含量一直在減小，可能為AgNO3分解所得的單質銀在高溫N2氣氛下不斷揮發所致。

綜合元素分析、UV?Vis光譜、紅外光譜、固體熒光光譜、質譜、摩爾電導率及TG?DSC等分析數據，根據硝基咪唑衍生物配合物的文獻[25]，初步確定配合物2的可能結構為二配位直線型的配合物，如Scheme 2所示。

Scheme 2 Structure of complex 2

2.2 配合物1的晶體結構

配合物1晶體屬于單斜晶系的C2/c空間群。單晶衍射結果表明，配合物1為一個對稱的雙核結構，含有4個配位的醋酸根，每一個醋酸根都是與2個銅離子二齒橋聯配位，Cu—O鍵長為0.195 5～0.198 9 nm(表2)，構成了槳輪籠型結構，其軸向分別被咪唑環上的N占據，Cu—N鍵長為0.219 1 nm。在雙核銅籠型結構中，2個銅離子間的距離(0.265 7 nm)比2個銅原子的范德華距離(0.286 nm)短，比2個銅離子的金屬半徑之和(0.255 nm)稍長，證明配合物中存在Cu與Cu之間的弱相互作用[26]。配合物中每個五配位的銅離子具有四方錐幾何構型，與Cu配位的4個氧原子是共面的，構成了四邊形的錐底，錐頂被軸向的咪唑環上N占據(圖4)。由于硝基及甲基的位阻效應，配體的2個咪唑環發生了很大程度的扭曲，環平面幾乎呈90°角。在相鄰分子之間，含硝基的咪唑環上的H6—C6與醋酸根的O6形成分子間氫鍵C6—H6…O6(C6…O6 0.246 4 nm，∠C6—H6…O6=138.13°)。醋酸根的甲基的H11—C11與配體咪唑環上未配位的3位N4也存在氫鍵C11—H11…N4(C11…N4 0.265 2 nm，∠C11—H11…N4=142.05°)。通過這些分子間氫鍵把各配合物分子連接成一維鏈，鏈與鏈之間又通過咪唑環的π?π堆積(咪唑環之間距離為0.334 9 nm)構筑為二維的層狀超分子結構(圖 5)。

圖4 配合物1的橢球概率30%的分子結構圖Fig.4 Molecular structure of complex 1 with thermal ellipsoids at 30% probability level

表2 配合物1的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complex 1

圖5 配合物1的二維結構Fig.5 Two?dimensional structure of complex 1

2.3 配合物2溶液的穩定性

室溫下測定了配合物2在Tris?HCl緩沖液(pH=7.1)中0、24、48 h的UV?Vis吸收光譜。圖6表明，在Tris?HCl緩沖液中，配合物2的UV?Vis光譜隨時間變化基本保持不變，表明配合物2在溶液中是基本穩定的[27]。

圖6 配合物2在Tris?HCl緩沖液(pH=7.1)中的UV?Vis光譜Fig.6 UV?Vis spectra of complex 2 in Tris?HCl buffer(pH=7.1)

2.4 配體及配合物與ct?DNA相互作用

首先用紫外吸收光譜對配體L及其配合物與ct?DNA的相互作用進行了表征。從DNA濃度對配體及配合物1、2的紫外吸收光譜的影響可以看出(圖7)，隨著向配合物中滴加ct?DNA量的增加，配體L的紫外吸收表現為略微的減色效應，最大吸收峰幾乎沒有發生位移。而配合物1和2在240和340 nm附近的紫外雙吸收峰發生了擾動，尤其是240 nm附近電子吸收峰的位移和強度都發生了改變，其最大吸收峰發生了紅移(≥2 nm)，且有一定程度的增色效應。出現這種現象可能是配合物與DNA結合，導致了溶液中配合物聚集以及配合物分子之間氫鍵的破壞[28?30]。

圖7 不同濃度的DNA存在時配體L及其配合物1、2的紫外吸收光譜Fig.7 UV absorption spectra of ligand L and its complexes 1,2 in the presence of DNA with different concentrations

采用熒光光譜對配體L及其配合物與ct?DNA的相互作用進一步進行研究。DNA濃度對配體及配合物1、2的熒光光譜的影響如圖8所示。隨著DNA濃度的增大，配合物1的熒光光譜強度明顯增加，這說明配合物1與DNA有較強的相互作用。而配體L及配合物2的熒光強度隨著DNA濃度的增加逐漸減小，發生明顯的減色效應。配體L的熒光發射峰發生了較大的紅移，配合物2的峰則未觀察到偏移。當小分子與DNA以靜電結合模式作用后，二者在水溶液中互相碰撞發生能量交換，可導致小分子的熒光光譜發生猝滅[31]。由此推測，配體及配合物2可能與DNA以靜電結合或溝渠結合模式相互作用。

圖8 不同濃度的DNA存在時配體L及其配合物1、2的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra of ligand L and its complexes 1,2 in the presence of DNA with different concentrations

從配體L及配合物濃度對DNA黏度的影響曲線(圖9)可以看出，隨配體L及配合物2濃度的增加，DNA的相對黏度幾乎不變，可能是由于它們以靜電結合或溝渠結合模式與DNA相互作用，因為二者相互作用較弱，DNA雙螺旋結構未發生變化，因而黏度變化不大。這與光譜實驗結果一致。而DNA的相對黏度隨配合物1濃度的增加顯著降低，這說明配合物1可能以部分插入方式使DNA雙螺旋發生扭曲，導致其黏度減小[32]。

圖9 配體及其配合物1、2濃度增大對DNA黏度的影響Fig.9 Effects of increasing concentrations of ligand L and its complexes 1,2 on viscosity of DNA

2.5 配體及其配合物抗厭氧菌活性研究

對配體L及其配合物1、2進行抗厭氧菌活性試驗，并以經典的抗厭氧菌藥物甲硝唑(Metronidazole)作為對照，測試結果如表3所示。結果表明，參與抑菌實驗的所有藥物對A.a的抑菌效果更強，而配體L對A.a的抑菌效果還要強于甲硝唑，其MIC值最小，但其2種配合物的抗A.a菌活性與甲硝唑相當，說明金屬離子并未起協同作用。而對于S.mutans的抑菌活性高低順序為配合物2>配體>配合物1，甲硝唑對變異鏈球菌幾乎無抗菌活性，說明這些藥物對不同厭氧菌菌株的抗菌性有一定的選擇性。

表3 配體L和配合物1、2及其他化合物對S.mutans和A.a的MICTable 3 MIC of ligand L,its complexes 1,2 and other compounds on S.mutans and A.a

硝基咪唑類化合物抑菌的作用機制研究結果表明，硝基咪唑類化合物能有效地滲透細菌的細胞膜，與細菌的DNA螯合形成復合物，抑制DNA復制，進而達到殺滅致病菌之功效[33]。雖然化合物與DNA相互作用的結果表明，配合物1與DNA相互作用較強，但其抗菌活性卻并非最高，說明金屬配合物抗厭氧菌機制不完全是靶向于細菌的DNA。金屬配合物抗厭氧菌機制較為復雜，還需要進一步研究。

3 結 論

設計、合成了N，N′?二甲基?5?硝基?2，2′?聯咪唑(L)的銅、銀配合物[Cu2(L)(Ac)2]2(1)和[Ag(L)(NO3)]·H2O(2)，測定了配合物1的單晶結構，通過元素分析、UV?Vis、FT?IR、固體熒光光譜、質譜、摩爾電導率及熱重分析等測試方法對配合物2進行了表征。結果表明有機配體L分別與醋酸銅、硝酸銀作用形成了結構不同的配合物，配合物1是一個由醋酸根橋聯的雙核對稱槳輪籠型結構的配合物，而配合物2可能是一個直線型的單核配合物。紫外吸收光譜、熒光光譜及黏度分析法的結果表明配合物1與ct?DNA相互作用模式可能為部分插入，而配體及配合物2則為靜電或溝渠作用模式。配體L對伴放線放線桿菌(A.a)表現出優于甲硝唑的抗厭氧菌活性，有望成為一種有效的抗厭氧菌藥物。