金魚源維氏氣單胞菌JY01全基因組測序及生物信息分析

吳尉鳳 饒秋華 柯文輝 劉洋 卓藝蓉 鄭欣欣 羅土炎

摘 要：維氏氣單胞菌（ Aeromonasveronii ?JY01）是從福州某養殖場內金魚爛尾、腐皮和潰瘍等病灶處分離出的1株革蘭氏陰性優勢菌。為了解其基因組結構及功能特征，基于IlluminaPE150和Pacbio測序平臺對維氏氣單肥菌菌株JY01進行全基因組測序，并對測序數據進行組裝和組分分析，利用生物信息學手段進行基因預測與功能注釋、同時預測致病因子和耐藥基因。結果表明：維氏氣單肥菌菌株JY01基因組序列長度為4.97 Mb，GC含量為58.17%;共預測到4601個編碼基因、31個rRNA、16個基因島及124個tRNA;其中，3461個基因在COG中獲得注釋，3082個基因聚集到GO聚類分析中，4345個基因在KEGG代謝通路中富集，預測維氏氣單胞菌菌株JY01攜帶13種毒力因子包含240個相關毒力基因及9大類抗生素耐藥性包含175個抗生素耐藥基因。

關鍵詞：金魚;維氏氣單胞菌;全基因組測序;基因注釋

中圖分類號：S 943?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）07-0018-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.07.003

Whole Genome Sequencing and Bioinformatic Analysis of ?Aeromonas Veronii ?JY01 from Goldfish

WU Weifeng1， RAO Qiuhua2， KE Wenhui3， LIU Yang2， ZHUO Yirong1， ZHENG Xinxin1， LUO Tuyan2*

（1. Fujian Ocean Vocational College， Fuzhou， Fujian 350013， China; 2. Institute of Agricultural Quality Standards

and Testing Technology / Fujian Key Laboratory of Agroproducts Quality and Safety， Fujian Academy of

Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China; 3. Institute of Agricultural Economics and

Scientific Information， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： ?Aeromonas veronii ?JY01 is a strain of dominant gramnegative bacterium isolated from the lesions of goldfish， such as rotten tails， rot， and ulcers in a farm in Fuzhou. In this study， the whole genome of the strain of ?Aeromonas veronii ?JY01 was sequenced based on the IlluminaPE150 sequencing platform and Pacbio sequencing platform. The sequencing data was assembled and analyzed， the gene prediction and functional annotation were performed by bioinformatics methods， meanwhile the prediction of pathogenic genes and drug resistance genes were carried out. The results showed that the genomic sequence length of the strain of ?Aeromonas veronii ?JY01 was 4.97 Mb， and the GC content was 58.17%. A total of 4601 encoding genes， 31 rRNA， 16 gene islands and 124 tRNA were predicted， among which， 3461 genes were annotated in COG， 3082 genes were aggregated in GO cluster analysis， and 4345 genes were enriched in KEGG metabolic pathway. It was predicted that the strain of ?Aeromonas veronii ?JY01 carried 13 virulence factors including 240 related virulence genes， and 9 types of antibiotics resistance including 175 antibiotic resistance genes.

Key words： Goldfish; ?Aeromonas veronii ; Whole genome sequencing; Gene annotation

維氏氣單胞菌 Aeromonas veronii 隸屬于氣單胞菌科Aeromonadaceae氣單胞菌屬 Aeromonas ，革蘭氏染色陰性，端生或多生鞭毛短桿菌。該菌株由HiekmanBrenner等于1983年從臨床腹瀉病人的糞便中分離，于1987年利用DNAblot法首次鑒定為氣單胞菌屬內的新種[1]。因其能產生多種毒力因子，如氣溶素、腸毒素以及菌毛、S層、莢膜、內毒素（LPS）和外膜蛋白（OMP）等粘附因子等[2-4]，該菌株對人和多種水生動物具有很強的致病性。魚類感染維氏氣單胞菌后主要出現皮下點狀潰爛、皮膚隆起、出血等癥狀。陸夢瑩等[5]發現懷頭鯰感染維氏氣單胞菌后表現為明顯出血、皮膚潰瘍、鰭條充血、肛門紅腫外突等臨床癥狀;田甜等[6]發現中華鱘感染維氏氣單胞菌后游動緩慢、食欲差且反應遲鈍，體表口四周、眼眶、鰭條及側骨板充血，肛門紅腫，部分病鱘胸鰭出現蛀鰭現象。

本研究從福州某養殖場內金魚爛尾、腐皮等病灶處分離純化出1株維氏氣單胞菌優勢菌JY01。為了深入研究菌株JY01潛在的致病機制和耐藥機制，用于流行病學、疫苗開發、微生物進化等領域。本研究采用第二代Illumina與第三代PacBio平臺相結合的測序技術對維氏氣單胞菌JY01進行全基因組測序，從而獲得其全基因組序列，在KEGG、SwissProt、GO、NR和COG數據庫中對菌株JY01基因功能進行注釋、預測其致病因子和抗性基因，以期為金魚維氏氣單胞菌病的防控研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 維氏單胞菌菌株JY01來自實驗室前期從自然發病的金魚潰瘍、爛尾和腐皮等病灶處分離的1株優勢菌株，用于全基因組測序分析。

1.1.2 試劑材料 腦心浸出液培養基（BHI，BectoTM Brain Heart Infusion）購自BD中國代理機構，細菌基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 菌株的全基因組測序與組裝

采用DNA提取試劑盒提取菌株JY01基因組DNA，其純度和完整性利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用Qubit方法進行定量。采用Covaris gTUBE將經電泳檢測合格的DNA樣品打斷成構建文庫所需大小的目的片段，按照PacBio SMRT全基因組DNA建庫流程建立10 kb文庫，建庫后根據PacBio SMRT RS Ⅱ 測序平臺上機流程進行全基因組測序;同時質量合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段，利用DNA文庫構建（NEB， USA）試劑盒，構建350 bp小片段文庫，步驟為：末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等，然后利用Illumina NovaSeq PE150測序。

過濾掉測序質量值低的reads，保留高質量reads即Clean Data。使用Unicycler軟件（https：//github.com/rrwick/Unicycler）[7]對Clean Data進行基因組組裝，并將染色體序列組裝成一個環狀基因組完成圖。

1.3 基因組組分分析

基因編碼框采用GeneMarkS（Version 4.17）[8]軟件從組裝結果中進行預測，用于后續的基因功能注釋分析。采用Tandem Repeats Finder（V.4.07b）軟件[9]和RepeatMasker（V.4.0.5）

[10]軟件分別對串聯重復序列和轉座子進行預測;通過tRNAscanSE軟件（Version 1.3.1）[11]和rRNAmmer軟件（Version 1.2）[12]分別預測tRNA和rRNA。采用CRISPRdigger（Version 1.0）[13]預測基因組中的CRISPR，使用IslandPathDIOMB 軟件預測基因島。

1.4 基因組的生物信息學分析

在已知的功能數據庫中比對（evalue≤1×10-5）預測到的基因蛋白序列，在每條序列的比對結果中，選取score最高的比對結果（identity≥40%，coverage≥40%）作為基因功能注釋的結果。參考數據庫分別為非冗余的蛋白質數據庫（Nr，NonRedundant Protein Database）[14]、SwissPro數據庫[15]、基因本體論（GO，Gene Ontology）[16]、蛋白相鄰類的聚簇（COG，Cluster of OrthologousGroups of proteins）[17]、碳水化合物活性酶數據庫（CAZy，CarbohydrateActive enZymes Database）[18]和京都基因和基因組百科全書（KEGG，Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes）[19]功能數據庫。

采用毒力因子數據庫（VFDB，Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）[20]和抗生素耐藥基因數據庫（CARD，the Comprehensive Antibiotic Research Database）[21]對菌株的基因組中所包含的毒力基因和耐藥基因進行比對。

2 結果與分析

2.1 測序結果的統計及組裝

采用第二代Illumina平臺與第三代PacBio平臺相結合的測序技術，對菌株JY01全基因組進行測序。質控后共得到1 661 097 097 bp clean data，組裝質控后的數據，并進行矯正和優化，最終獲得基因組序列長度為4 969 544 bp，（G+C）mol%含量為58.17%，平均測序深度為334.26 X（圖1）。

2.2 菌株JY01的基因結構

質粒是獨立于核基因組可自主復制的環狀DNA，普遍存在于原核生物細胞內。通過對組裝后的測序結果進行分析，在JY01菌株未發現相應的質粒序列。原核生物中的CRISPR序列與Cas gene（CRISPR相關基因，CRISPRassociated genes）起到免疫系統（CRISPRCas系統）的作用，能識別并使入侵的功能元件沉默，經CRISPRdigger程序預測發現菌株JY01含有2組CRISPR相關序列。非編碼RNA（ncRNA），如siRNA、snRNA、rRNA、tRNA等，從基因組上轉錄，可直接以RNA分子的形式發揮功能作用，菌株JY01中預測到的ncRNA 統計結果見表 1。基因島編碼蛋白具有多種功能，涉及發病機理和共生關系，還具有提高生物適應性等，菌株JY01基因組中預測到16個基因島。

2.3 預測蛋白的數據庫注釋

2.3.1 COG注釋結果 維氏氣單胞菌菌株JY01基因序列中預測到了4601個編碼基因。在COG數據庫得到注釋的有3461個蛋白質，占總量的75.22%。菌株JY01中預測到的蛋白序列注釋主要集中在以下功能（圖2），分別為E（氨基酸的運輸和代謝）355個，T（信號轉導機制）329個，R（僅適用于一般功能預測）297個，K（轉錄）296個，J（翻譯，核糖體結構與生物發生）261個，C（能源生產與轉換）240個，S（未知功能）232個，M（細胞壁/膜/膜生物合成）216個，P（無機離子的轉運與代謝）205個，G（碳水化合物的運輸和代謝）204個，H（輔酶的運輸和代謝）182個和N（細胞運動）180個。COG注釋結果顯示，關于碳水化合物的運輸和代謝的基因達204個，另外有182個基因注釋到輔酶運輸代謝，表明該菌株可能具有糖類代謝及產多種輔酶的功能。

2.3.2 GO注釋結果 維氏氣單胞菌菌株JY01編碼蛋白在GO數據庫中得到注釋共有3082個蛋白質序列，占總蛋白序列數量的66.98%。由圖3可知，在分子功能方面，主要被注釋到轉運活性、結合、催化活性、活動分子傳感器和核酸結合轉錄因子活性單元;在細胞組分方面，主要注釋到細胞、細胞部分、細胞器、高分子配合物單元;在生物學過程方面，主要與細胞內過程、代謝過程、定位、定位建立、生物調節、刺激反應、生物過程調節、信號發射、細胞組成組織或生物發生單元有關。

2.3.3 KEGG注釋結果 將測序結果與KEGG 數據庫進行比對分析發現，菌株JY01預測到的基因有4345個富集到KEGG Pathway的217條代謝通路中，占基因總量的94.44%;其中含有大于50個基因數的代謝通路有15個（表2）。KEGG富集結果表明，代謝途徑、次生代謝物的生物合成、抗生素的生物合成作為最主要的 3 條代謝通路，分別注釋到620、285和194個基因;另外，微生物在不同環境中的代謝、雙組分調節系統、碳代謝、ABC轉運蛋白、氨基酸生物合成、嘌呤代謝通路與菌株JY01基因組具有較高的相關度。

2.3.4 CAZy功能分析 與CAZy數據庫比對結果發現，菌株JY01的基因組中屬于CAZy家族的共有151個基因編碼的蛋白質結構域，其中包括40個蛋白基因屬于13類糖苷轉移酶家族（Glycosyl Transferases，GTs）、64個蛋白基因屬于34類糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs）、4個蛋白基因屬于3類碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs）、1個蛋白基因屬于1類輔助酶類（Auxiliary Activities，AAs）、42個蛋白基因屬于6類碳水化合物結合組件（CarbohydrateBinding Modules，CBMs）。菌株JY01基因組中未發現多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases，PLs），可能與該菌株在淡水環境中的生境相關。

2.3.5 SwissProt數據庫和NR數據庫注釋結果 菌株JY01的基因中序列與NR數據庫進行alignment發現，在NR數據庫中共有4431個基因得到相應注釋，主要集中到 Aeromonas veronii、Aeromonas、Aeromonas hydrophila、Aeromonas allosaccharophila、Aeromonas jandaei、Aeromonas salmonicida、Aeromonas caviae和Edwardsiellaanguillarum 這8類物種，數量分別為2149、1760、149、68、46、28、27和20個。SwissPro是一個精選的蛋白質序列數據庫，包括蛋白質結構、功能、翻譯后修飾、變異等信息，菌株JY01中有2397個基因的蛋白序列功能在該數據庫中得到有意義的注釋。

2.3.6 毒力因子分析 與VFDB數據庫alignment表明，菌株JY01共含有13種毒力因子及240個相關毒力基因，其中與細菌粘附功能相關的毒力因子有6個包含148個基因，說明該菌株對宿主具有較強的黏附能力，這是病原菌入侵的第一步;與分泌系統相關的毒力因子有3個包含88個基因;與毒素相關的毒力因子有4個包含4個基因（表3）。

2.3.7 耐藥基因分析 CARD數據庫注釋結果發現，菌株JY01含有多種類型的抗生素耐藥基因，包括9大類共175個抗生素耐藥基因。從表4可知，外排泵系統基因數量最多，主要包括 macB （18個）、 patA （12個）和 lmrB （8個）等107個耐藥基因。其次為多抗基因簇包含13個耐藥基因，其余為介導磺胺類、多肽類抗生素（多粘菌素）、四環素類抗生素（四環素）、二氨基嘧啶類、β內酰胺類和喹諾酮類等抗生素耐藥基因。

3 討論

基因組測序伴隨著生物信息學的發展，給研究微生物多樣性、進化以及物種間相互作用等帶來了全新的機會。在動植物病原菌的鑒定與分析方面，全基因組測序技術已廣泛被引用，其可在分子水平上系統闡明致病菌的遺傳進化地位、致病機理和與寄主的互作機制等，為病原菌的進化關系確定、耐藥性的特征分析、預防策略的制定及疫苗開發奠定了理論基礎。而維氏氣單胞菌是一類兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，在水環境以及土壤中普遍存在，是一種條件致病菌，可同時夠感染人類和魚類，在水產業上常常給養殖業帶來重大經濟損失。因此，本研究旨在通過全基因組測序和生物信息學分析，了解金魚源維氏氣單胞菌JY01的基因組結構和功能，為進一步研究其致病機制和耐藥機制提供重要生物信息學基礎。

經denovo組裝后，菌株JY01的基因組序列長度為4.97 Mb，共預測得到4601個編碼基因，有4431個注釋到已知功能蛋白，涉及轉運、調控、環境適應和次級代謝活動等。GO注釋結果表明，催化活性和結合等分子功能方面是菌株JY01的蛋白功能主要集中區，該功能方面的蛋白參與大量的代謝過程，同時包括對外界環境或自身的催化活性，為蛋白質的分泌過程和功能發揮提供了分子基礎。COG分類具有局限性，菌株JY01內基因將近25%沒有在COG里得到分類或功能注釋，因此該基因組中有很多基因有待于更深層次的基因功能發掘。KEGG注釋結果表明，菌株JY01的代謝途徑豐富完整，能夠使生物體自身及外界不斷進行能量和物質交換，維持自身活動必需物質和對外界環境及時作出反應，增強病原菌的環境適應性。

細菌對抗抗生素機制主要包括：加快細菌主動外排作用，排出菌體內的抗生素;影響細胞膜滲透作用進而阻礙抗菌藥物的進入;產生滅活酶或鈍化酶破壞抗生素的活性;改變抗生素作用靶位等[22]。菌株JY01基因組上預測到9大類抗性基因，包含175個抗生素耐藥基因，外排機制耐藥基因數量最多，占61.14%。呈外排機制的耐藥基因多數情況下可表現為多種抗菌藥物的耐藥性，如evgA、HNS、evgS同時具備RND和MFS兩種耐藥機制，TolC同時具備ABC、RND、MFS等3種耐藥功能，soxS基因除兼備MFS3、RND、ABC等3種外排機制外，還具有降低抗生滲透性和改變抗生素作用靶點的功能。豐富的抗生素外排系統表明菌株JY01可能處于高濃度的抗生素環境中，巨大的選擇壓力導致其具有多種耐藥性質。VFDB數據庫比對發現，菌株JY01包含著多種毒力因子及相關毒力基因。主要集中在吸附和分泌系統上，分別占60.66%和36.07%。毒力因子中鞭毛、纖毛、粘附和侵襲、Ⅳ型菌毛提供運動占有重要的比例;而分泌系統能將蛋白整合在細胞膜或直接分泌到環境與靶細胞內，參與多種生理學過程，如病原菌的致病性、細胞黏附和環境的適應性等[23]。在毒力基因中，由某些基因共同調控形成的生物膜，構成了抗生素耐藥的第一道防線機制。本研究對菌株JY01進行了全基因組測序與分析，有利于更全面地認識該菌株基因組的結構與功能，為該菌株的感染治療和長期防控提供參考依據。

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（責任編輯：林玲娜）