hENT-1表達水平對胰腺癌吉西他濱輔助化療的影響

陳垚宇，王 喆，王 昭，荊 鑫，張 強

（1.珠海市人民醫院普通外科，廣東 珠海 519000；2.內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽胰脾外科）

全世界每年因為胰腺癌而死亡的人數大于200，000例[1]。我國最新的統計報告指出，每年發病人數接近10萬人，其中男性和女性分別約為5.4萬人和4.1萬人。而死亡人數更達到了8.4萬，男性約為4.8萬和女性約為3.6萬[2]。其進展快且隱匿，許多病人發病早期沒有任何癥狀，一旦出現腹痛、黃疸、貧血等癥狀時，病情可能達到晚期，從而喪失根治性手術機會，超過半數患者無法接受根治手術[3]。由于該病惡性度高、預后極差，為防止癌細胞殘留或癌癥復發，術后應采取輔助化療。臨床上通常選用較5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）副作用少的吉西他濱（Gemcitabine，GEM）進行輔助化療[4，5]。隨著臨床應用，人們逐漸發現GEM輔助化療個體間的效果不盡相同。一些胰腺癌組織對GEM化療敏感性欠佳，可能導致部分病人僅獲得有限的效果。因為hENT-1是介導GEM進入腫瘤細胞的主要運載體，所以部分學者認為其表達水平可能影響GEM輔助化療敏感性[6]。

人類平衡型核苷轉運體-1（Human equilibrative nucleoside transporter-1，hENT-1）是具有疏水α-螺旋結構的跨膜蛋白[7，8]。該轉運體除在許多正常組織中分布外，亦在腫瘤中差異表達[21～25]。它不僅幫助轉運人體基本生理生化反應過程中所需物質，而且具備了轉運核苷類藥物的能力。親水性核苷類藥物GEM不能通過被動擴散的方式穿過細胞膜，所以需要依賴hENT-1進入胞漿[9]，以發揮抑制腫瘤生長效果。

理論上GEM可顯著提高胰腺癌病人的總生存期及無病生存期。但臨床上其療效卻有著明顯的差異，GEM敏感性差是延長病人OS和DFS的主要困難。至此，全世界學者們都在研究造成其敏感性不一的原因。可惜，時至今日，有關hENT-1是否影響胰腺癌GEM輔助化療敏感性的研究結論并未形成統一。如Farrell[6]認為hENT-1表達水平與胰腺癌GEM輔助化療敏感性相聯系，可影響病人的OS以及DFS。但是，Poplin[10]等學者則認為hENT1低表達對GEM化療敏感性無影響，病人之間的OS未見明顯差異。由于國內有關hENT-1的研究缺乏，且此研究區域暫無有關文獻，故此次研究具有一定意義。

筆者對近5年附屬醫院胰腺癌GEM輔助化療的患者采取回顧性分析，并經免疫組織化學手段測定胰腺癌組織中hENT1的表達水平，最后對相應預后情況作出對比分析。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

PBS緩沖液、DAB顯色液、中性樹膠、乙醇、修復液、蘇木素染色劑、兔多克隆抗hENT-1抗體等。

1.2 儀器

切片機、烤片機、展片臺、光學顯微鏡、顯微鏡攝像系統、冰箱、溫箱。

1.3 組織標本

近5年附屬醫院55例胰腺導管腺癌切片。

2 病例收集及觀察指標

2.1 實驗對象

入選標準：（1）行胰腺癌根治術后，病理學診斷為導管腺癌；（2）未行新輔助放、化療；（3）經GEM為主輔助化療；（4）滿足免疫組織化學手段標本；（5）臨床資料，如年齡、性別、民族、飲酒情況、腫瘤位置、腫瘤大小、病理級別、TNM分期、術式無明顯缺失；（6）無較為嚴重的并發癥；（7）隨訪至2020.01.01。

排除標準：（1）患有嚴重心、肺、腦、腎、免疫缺陷等基礎疾病；（2）腫瘤晚期或TxNxM1，無法行根治術；（3）病人失訪或拒絕規律隨訪病情。

2.2 觀察指標

（1）經免疫組化后hENT-1的染色強度、范圍；（2）總體生存期和無病生存期；（3）年齡、性別、民族等情況；（4）腫瘤位置及直徑、術式、病理級別、TNM分期。

3 實驗方法

3.1 制作胰腺癌切片

3.2 免疫組化染色

按順序進行：脫蠟→水化→抗原修復→去除內源性過氧化物酶→封閉→孵育一抗→孵育二抗→DAB顯色→蘇木素復染→分化→返藍→脫水→透明→封片。

3.3 免疫組織化學評分

將染色強度分為4級，利用同一切片中淋巴細胞的著色度進行標準化，3分即強著色，腫瘤細胞的染色程度高于淋巴細胞；2分即中等著色，兩種細胞染色程度一致；1分即淺著色，腫瘤細胞的染色程度弱于淋巴細胞；0分即無著色。而染色范圍計分即評估單張切片范圍內著色的腫瘤細胞占該切片總腫瘤細胞的比例，4分：＞50%陽性，3分：26%～50%陽性；2分：11%～25%陽性；1分：≤10%陽性；0分：細胞呈陰性或比例＜1%。最終，hENT-1染色水平評分由上述兩項相加，強陽性（++）：≥7分；陽性（+）：5～6分；弱陽性（+-）：3～4分；陰性（-）：＜2分。低表達組由陰性及弱陽性組組成，高表達組則由陽性及強陽性組組成。

4 醫學統計學分析

利用統計學軟件SPSS 20.0分析，正態分布數值以（±s）表示，計量資料采用方差分析或t檢驗。而計數資料應用卡方檢驗以及Fisher精確檢驗（當期望值＜5時）。以Kaplan-Meier生存曲線分析OS和DFS與hENT-1表達水平的相關性。病人的獨立預后因素分別以Log-rank檢驗及Cox regression模型進行分析。檢驗水準為α＝0.05，P＜0.05即差異存在統計學意義。

5 結果

5.1 hENT-1表達水平與病人預后的單因素生存分析

經Kaplan-Meier分析后示，hENT-1高表達組與低表達組的中位OS分別是20個月對10個月（見圖1），而DFS是15個月對6個月（見圖2）。hENT-1高表達組的OS及DFS明顯優于低表達組。

圖1 hENT-1表達水平與OS的KM生存曲線

圖2 hENT-1表達水平與DFS的KM生存曲線

5.2 hENT-1表達水平與病人預后的多因素生存分析

經Cox regression分析臨床資料中的變量后，其結果表明OS的獨立預后因素是hENT-1表達水平、病理級別和淋巴轉移情況（P＜0.05）。DFS的獨立預后因素是hENT-1表達水平和病理級別（P＜0.05）。

5.3 臨床資料與hENT-1表達水平

hENT-1表達水平分別與計量資料（病人年齡、腫瘤直徑）經t檢驗后，暫無統計學意義（P＞0.05），以及與計數資料（性別、民族、飲酒情況、腫瘤位置和病理等級）行χ2檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，臨床資料與hENT-1蛋白表達水平無相關性，暫不能認為其對hENT-1表達水平有影響。

6 討論

指南指出[12]，GEM是胰腺癌輔助化療的一線藥物。基本生命功能平穩的病人術后應積極使用GEM輔助化療。但是，化療前未知GEM化療敏感情況時，很難制訂最佳的化療方案。若有標記物能夠預測胰腺腫瘤對GEM輔助化療敏感性，可為化療藥物選擇提供思路，從而制訂個體治療方案。本研究發現hENT-1高表達病人比低表達病人使用GEM輔助化療生存期更長、敏感性更高，對GEM耐藥的可能性更低。而且，在GEM輔助化療下，其OS的獨立預后因素是hENT-1表達水平、病理級別和淋巴轉移情況（P＜0.05）。而DFS的獨立預后因素是hENT-1表達水平和病理級別（P＜0.05）。因此根據hENT-1表達水平預測胰腺癌術后GEM輔助化療效果有一定意義。但是，過往研究表明有爭議發生。Farell[6]等學者發現GEM組hENT-1表達與病人OS和DFS相關，而5-FU組則未見相關性，但該實驗將免疫組化染色結果分為3個等級，即＞50%腫瘤細胞染色的為高染色；＜50%染色者為無染色；介于兩者之間的為低染色。但上述分級方法忽略了染色強度深淺的情況。幾年后，Marechal等[13]也發現接受GEM化療的病人，hENT-1高表達與更長的生存期顯著相關（HR 0.34，P＜0.05），而未接受輔助化療的病人以及其他化療組無上述情況。而且，hENT-1是GEM輔助化療預后的獨立影響因素。由于胰腺癌復發率高，術后基本生命功能平穩的病人鮮有不進行輔助化療的，且不接受輔助化療病人無法追蹤，所以本研究無法構建非化療組，該方向研究需等待下一階段進行。Marechal[13]及Oba[15]都認為hENT-1高表達病人更應選擇GEM行輔助化療，因為高表達者獲益更多。對于hENT-1低表達的病人，有學者[14]認為不應采取GEM作為化療方案的主要藥物，因為低表達的病人術后使用GEM化療所獲得的效果欠佳。而5-FU相比之下具有更好的獲益，并且ESPAC-3試驗[14]亦證實這一點。

雖然hENT-1表達水平與胰腺癌GEM輔助化療療效具有相關性的觀點獲得以上研究支持，但仍有不少學者對此作出反對。如Fisher等[16]指出在GEM輔助化療中，hENT-1高表達水平者與OS無關，無法作為主要標記物來預測該藥化療敏感性。Ormanns等[11]則 利 用AIO-PK0104的 臨 床 資 料 進 行兩次實驗，所有結果均無法支持hENT-1可以作為預測性生物標記物。除此之外，一些學者[17，18]甚至懷疑hENT-1表達與GEM敏感性存在差異可能與免疫組化中所選擇的hENT-1抗體種類有關，如SP120兔抗體對測定的hENT-1表達水平可能存在缺陷。針對該情況，Kalloger等[19]認為10D7G2單克隆抗體和SP120多克隆抗體，均可檢測出hENT-1的表達水平。而且，兩者可相互補充某種有意義的信息，令研究對象分層更加全面，如療效的分層。

本研究探討胰腺癌hENT-1表達水平對吉西他濱輔助化療的影響，所入組的病人均接受胰腺癌根治術，并排除了其他明顯影響生存期的疾病。筆者認為同時使用10D7G2單克隆抗體和SP120多克隆抗體進行測定可以更全面地對病人hENT-1表達水平作出準確的評估。但是由于10D7G2國內無大量生產，以至獲取困難，故本次研究僅選用SP120多克隆抗體。本次染色評分綜合染色強度及范圍，可大大減少因顯色條件差而產生的誤判，臨床上采用該方法具有確切意義。本次研究所覆蓋到的范圍有限，無法對全國不同地區人群展開研究。今后仍需各位學者進行更深一步探研。

7 結論

hENT-1表達水平與GEM輔助化療預后相關。hENT-1高表達的病人比低表達者有更長的OS和DFS，說明高表達者的GEM敏感性更高。檢測hENT-1表達水平具有預測吉西他濱療效的意義。hENT-1表達水平和病理級別共同影響病人的OS和DFS，卻互不牽涉，其機制暫不明確。年齡、性別、腫瘤位置及大小、術式、TNM分期等暫未發現對hENT-1表達水平造成影響。