RP-HPLC法同時測定苓桂術甘湯中的甘草苷和原兒茶酸含量

孟 園，王來兵，于姝燕，郭曉宇，王 敏，于 娟，李 冰，劉 濤，陳建平＊

（1.巴彥淖爾市醫院藥劑科，內蒙古 巴彥淖爾 015000；2.內蒙古醫科大學藥學院）

苓桂術甘湯來自《傷寒雜病論》中的“金匱要略方劑”部分。苓桂術甘湯由四味常見藥材，即茯苓、桂枝、甘草、白術組成。此湯劑為祛濕劑，主治因中陽不足所致的心胸滿悶、短氣而咳、起則頭眩、氣上沖胸等癥[1，2]，具有健脾利濕、溫陽化飲等功效。在現代臨床醫學上，苓桂術甘湯常用于治療慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、梅尼埃綜合征、神經官能癥、慢性腎小球腎炎水腫、心源性水腫、慢性心力衰竭等癥，還可聯合短期低熱量飲食來控制Ⅱ型糖尿病患者的血糖[8，9]。苓桂術甘湯療效顯著、毒副作用低，具有較高的臨床應用價值[3～10]。

據文獻調研發現，目前對苓桂術甘湯的研究主要集中在臨床應用以及藥理作用方面，對其物質基礎的研究報道相對缺乏。為了充分研究苓桂術甘湯中的有效化學物質，本研究首次建立高效快速的反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定該方劑中甘草苷和原兒茶酸含量的方法，為苓桂術甘湯的質量控制及藥效物質基礎等研究提供新的依據及參考。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

AB135-S電子分析天平（瑞士，MettlerToledo）；Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國，ThermoFisher）；KM-410C型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品

茯苓、桂枝、白術、甘草飲片購自內蒙古天立藥業，所有藥材經由內蒙古醫科大學藥學院生藥學教研室渠弼副教授鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》要求。

甘草苷標準品（批號：G-009-181216，純度＞98%，成都瑞芬思公司），原兒茶酸標準品（批號：110809-201205，99.9%，中國食品藥品檢定研究院），乙腈（色譜純，美國，Merck），甲醇（美國，Fisher，色譜純），磷酸（85%水溶液，北京伊諾凱），超純水為實驗室自制，其余所用試劑藥品均為分析純。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μM）；在260 nm波長處檢測，柱溫25℃，流速1.0 mL·min-1，梯度洗脫（見表1），流動相為乙腈-0.1%磷酸水，進樣量為10 μL。此條件下，原兒茶酸及甘草苷能與其他化學成分完全分離，且原兒茶酸理論塔板數＞100000，甘草苷理論塔板數＞200000。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的甘草苷和原兒茶酸對照品。分別為4.23 mg和2.72 mg，置于燒杯中，加入少量甲醇溶液溶解后置于100 mL容量瓶中定容，配制成含42.3 μg·mL-1的甘草苷和27.2 μg·mL-1的原兒茶酸的甲醇混合液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取藥材粉末2.75 g（粉碎并過60目篩的茯苓1 g、桂枝0.75 g、甘草0.5 g、白術0.5 g），放置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，在功率40 kHz，頻率為200 W，超聲處理30 min，放至室溫，補足差重，搖勻，濕法抽濾，即得。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2”項下對照品溶液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇至定容。按照“2.1”項下的條件檢測，以進樣量為橫坐標。峰面積為縱坐標，測繪標準曲線，得甘草苷的回歸方程為Y=145.0X+0.089（r=0.9992；n=6）、原兒茶酸的回歸方程為Y=632.7X+0.074（r=0.9993；n=6）。結果表明，原兒茶酸、甘草苷濃度分別在1.36～13.60 μg·mL-1與2.12～21.15 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系[11]。

2.5 精密度試驗

精密量取同一批樣品溶液，按照“2.1”項下條件連續進樣6次，測定得甘草苷和原兒茶酸含量的RSD分別為0.18%、0.15%，結果表明該實驗方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密量取一定量的藥品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進行測定，測得甘草苷、原兒茶酸含量的RSD分別為0.33%、0.77%，實驗結果顯示樣品溶液在12 h內穩定性較好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同批次藥材，按照“2.3”項下的實驗方法，平行制備6份溶液，并按“2.1”項下實驗條件檢測，結果測得甘草苷和原兒茶酸的平均含量分別為618.6 μg·g-1和49.09 μg·g-1，RSD均為0.9%，實驗結果表明該方法重復性良好。（見表2）。

表2 含量測定結果Tab.2 Content determination results

2.8 干擾性試驗

分別量取空白溶劑適量、供試品試液適量、混合對照品試液適量于樣品瓶中，按“2.1”項下實驗條件檢測。供試品溶液色譜圖，在混合對照品試液的甘草苷和原兒茶酸相應的位置上，有保留時間相同的色譜峰，且空白溶劑中沒有相應保留時間的色譜峰，空白溶劑對甘草苷及原兒茶酸的測定無干擾，說明該方法專屬性良好（見圖1）。

圖1 干擾性試驗Fig.1 Interference test

2.9 回收率試驗考察

精密稱取同批次已知含量的供試品6份，分別加入80%、100%、120%的甘草苷和原兒茶酸對照品試液各2份，按照“2.3”項下方法制備，按照“2.1”項下條件進樣檢測，測得甘草苷和原兒茶酸的平均回收率分別為98.37%，RSD=0.9%和98.51%，RSD=1.1%。結果表明該實驗方法加樣回收率良好[12]（見表3）。

表3 加樣回收率試驗結果Tab.3 Test results of sample addition rocovery

3 討論

3.1 提取方法的選擇

樣品溶液制備的預實驗中，分別采用甲醇、無水乙醇、70%乙醇和水作為溶劑超聲處理提取樣品。測定顯示，以甲醇作為提取溶劑，被測定成分溶解度好，提取率高，得到的兩成分色譜峰峰形、高度均良好。

3.2 流動相的選擇

分別采用了乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-0.1%磷酸水進行梯度洗脫。結果表明用乙腈-0.1%磷酸水進行梯度洗脫，甘草苷及原兒茶酸均有較好的峰型和分離度；而用甲醇-0.1%磷酸水，甘草苷峰無法分開，僅原兒茶酸峰型和分離度良好。

3.3 檢測波長的選擇

在200～400 nm范圍內用紫外-可見分光光度計對甘草苷和原兒茶酸進行掃描，結果表明甘草苷和原兒茶酸分別在278 nm和260 nm處有最大吸收。由于苓桂術甘湯中原兒茶酸的含量比甘草苷的含量低，若以278 nm作為檢測波長時，原兒茶酸的峰面積太小，難以測量，而甘草苷在260 nm處峰型穩定，故選擇260 nm作為檢測波長同時對兩組成分進行測定。

本試驗成功建立了RP-HPLC法同時測定苓桂術甘湯中原兒茶酸和甘草苷的含量，通過方法學考察表明，所建立的方法簡單靈敏、快速高效、易于操作，為苓桂術甘湯的質量控制研究提供理論參考。