隱丹參酮對人下咽鱗癌細胞FaDu增殖及遷移的影響

高 琳，費 靜，劉 毅，李曉紅

1.西南醫科大學附屬醫院健康管理中心（瀘州646000）；2.西南醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科（瀘州 646000）

下咽鱗癌是一種原發于下咽部且侵襲性高的頭頸部惡性腫瘤，由于其發病位置隱匿且癥狀不典型，大部分患者就診時已為晚期[1]。一直以來，對下咽鱗癌早期診斷及治療缺乏有效的治療手段，手術、放療和化療是其主要治療方式[2]，導致患者術后的整體生存情況并不理想，因此亟需新的理念及治療藥物來改善現狀。

隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）是傳統中藥丹參中的主要脂溶性成分，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用[3-4]。而近年來，CPT 被報道可抑制肝癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞增殖，阻礙腫瘤細胞侵襲與轉移，表現出較好的抗腫瘤活性[5-8]。但目前并無CPT 作用于下咽鱗癌的研究報道。本研究以人下咽鱗癌細胞FaDu 為研究對象，探討CPT對FaDu細胞增殖及遷移的影響。

1 材料

1.1 細胞

人下咽鱗癌細胞FaDu，購自中國科學院細胞庫。

1.2 藥物及試劑

隱丹參酮，胎牛血清（Biological Industries），高糖DMEM 培養基（Hyclone），0.25%胰蛋白酶（含EDTA，Thermo Fisher），RIPA 強裂解液（Beyotime），Transwell 小室（24 孔8.0um，Corning），CDK4、Cyclin D、GAPDH抗體（Proteintech），Vimentin抗體（Servicebio），AKT抗體（ZEN-BIO），p-AKT抗體（Beyotime）。

1.3 儀器

倒置熒光顯微鏡（Olymplus，日本）；全光譜分光光度計（Thermo Fisher，美國）；電泳儀、垂直電泳槽（Bio-Rad，美國）。

2 方法

2.1 細胞培養

人下咽鱗癌細胞FaDu 常規培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基中，待細胞長至90%密度左右時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養，并進行后續實驗。

2.2 CCK-8實驗

參照CCK-8試劑盒（Beyotime）操作。

2.3 克隆形成實驗

在6 孔培養板中每孔接種1 000 個FaDu 細胞，加入含CPT 的新鮮高糖DMEM 培養基處理24 h 后，換成新鮮高糖DMEM 培養基繼續培養。7 d 后用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色后進行拍照。

2.4 劃痕實驗

在6 孔培養板中每孔接種6×105個FaDu 細胞，第2 d用黃槍頭垂直于孔底進行劃痕。加入含CPT的新鮮無血清高糖DMEM培養基，培養24 h后，拍照分析。

2.5 Transwell遷移實驗

將Transwell小室放入24孔板中，在每個上室中加入含FaDu細胞的無血清高糖DMEM培養基，向每個下室中加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，培養24 h后，多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下對小室下層的細胞進行拍照計數。

2.6 蛋白印跡（Western blot）實驗

收集不同濃度CPT處理的細胞，加入RIPA強裂解液提取蛋白，再利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜，一抗4 ℃孵育過夜，HRP 標記的二抗室溫孵育2 h后，通過ECL化學發光于凝膠成像系統中成像。

2.7 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均值±標準差（）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 CPT抑制FaDu細胞增殖

CCK-8實驗檢測CPT對FaDu細胞增殖的影響，見圖1。與對照組（DMSO 組）相比，不同濃度的CPT（2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM）作用于人下咽鱗癌細胞FaDu 24 h、48 h 及72 h 后，表現出不同程度的抑制作用。隨CPT 濃度的增加，對FaDu 細胞增殖的抑制作用逐漸增強，且呈現濃度和時間的依賴性關系，見表1。各加藥濃度組與對照組（DMSO組）相比具有統計學意義（P＜0.01）。同時CPT 對FaDu 細胞在24 h、48 h 及72 h 的半數致死劑量IC50 分別為15.42 μM、6.49 μM、3.46 μM。

表1 不同濃度CPT處理后各組細胞的相對存活率

3.2 CPT抑制FaDu細胞克隆形成

細胞克隆形成實驗分析CPT 對FaDu 細胞克隆形成的影響，見圖2。與對照組（DMSO組）相比，不同濃度的CPT（2.5 μM、5 μM、10 μM）對人下咽鱗癌細胞FaDu克隆形成能力表現出不同程度的抑制作用。隨CPT濃度的增加，對FaDu細胞克隆形成的抑制作用越來越強（圖1）。統計各組細胞克隆形成的數量并計算各組的克隆形成率，各組的克隆形成率分別為DMSO 組（67.0% ± 4.9%）、CPT 2.5 μM 組（30.1% ±1.8%）、CPT 5 μM 組（13.2%±3.3%）、CPT 10 μM 組（7.5%±2.2%），各加藥濃度組與對照組相比具有統計學意義（P＜0.01），且單因素方差分析表明F=197.504，P＜0.001。

圖1 CPT對FaDu細胞克隆形成能力的影響

3.3 CPT抑制FaDu細胞遷移

細胞劃痕實驗與Transwell遷移實驗分析CPT對FaDu 細胞遷移能力的影響（圖3）。細胞劃痕實驗結果發現CPT 能明顯抑制人下咽鱗癌細胞FaDu 劃痕愈合能力，且隨CPT濃度的增加，其抑制作用越來越強（圖2）。統計各組24 h 后的細胞愈合率，DMSO 組84.5%±3.8%、CPT 2.5 μM組65.3%±1.3%、CPT 5 μM組39.5%±2.1%、CPT 10 μM 組12.6%±3.2%，各加藥濃度組與對照組（DMSO組）相比具有統計學意義（P＜0.01），且單因素方差分析表明F=388.287，P＜0.001。。Transwell 遷移實驗結果表明CPT 能明顯抑制人下咽鱗癌細胞FaDu遷移能力，且隨CPT濃度的增加，其抑制作用越來越強（圖3）。與對照組（DMSO組）相比各組的相對細胞遷移率為：DMSO 組（100%± 4.0%）、CPT 2.5 μM 組（77.2% ± 3.7%）、CPT 5 μM組（44.8%±4.2%）、CPT 10 μM 組（10.0%±1.4%），各加藥濃度組與對照組相比具有統計學意義（P＜0.01），且單因素方差分析表明F=375.848，P＜0.001。

圖2 細胞劃痕實驗檢測CPT對FaDu細胞遷移能力的影響

圖3 Transwell遷移實驗檢測CPT對FaDu細胞遷移能力的影響

3.4 CPT抑制FaDu細胞周期及遷移相關蛋白的表達

為進一步闡明CPT 調控FaDu 細胞增殖和遷移的分子機制，采用Western blot 檢測不同濃度的CPT處理FaDu細胞后細胞周期相關蛋白CDK4、Cyclin D及EMT 相關蛋白Vimentin 的表達情況。Western blot結果如圖5 所示，與對照組（DMSO 組）相比，CDK4、Cyclin D 及Vimentin 蛋白相對表達量隨CPT 濃度的增加而明顯下調。進一步灰度值分析發現，加藥濃度組（5 μM 組與10 μM 組）與對照組相比各蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4）。

3.5 CPT抑制AKT蛋白的表達

AKT 蛋白作為PI3K/AKT 信號通路核心蛋白，經磷酸化激活形成p-AKT 后可進一步調控下游細胞周期相關蛋白CDK4、Cyclin D 及EMT 相關蛋白Vimentin的表達，參與細胞增殖及轉移的調控。通過Western blot 檢測不同濃度CPT 處理FaDu 細胞后AKT蛋白的表達，結果顯示AKT及p-AKT蛋白相對表達量隨CPT 濃度的增加而明顯下調。進一步灰度值分析發現，各加藥濃度組與對照組相比各蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01）（圖4）。

圖4 Western blot檢測不同濃度CPT處理FaDu細胞后相關蛋白的表達變化

4 討論

下咽癌是一種少見的頭頸部惡性腫瘤，約占頭頸部惡性腫瘤的3%～5%，其病理類型以鱗狀細胞癌為主[9-10]。由于早期下咽癌的癥狀與體征并不明顯，70%～85%的患者在確診時已處于Ⅲ期或Ⅳ期，且極易發生頸部淋巴結轉移，導致患者預后差、生存率低[11-12]。盡管對下咽癌的手術治療、放療、化療及靶向藥物治療取得了重要進展，但下咽癌患者的預后尚無明顯改善[13]。因此，有必要尋找與下咽癌治療進展相關的新策略。

隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）作為一種從丹參中提取的天然化合物，目前研究表明其除在心血管疾病及神經退行性疾病中表現出良好的治療前景[14-16]，在多種腫瘤（如肝癌、胰腺癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌等）中也顯示出較好的抗腫瘤活性[17-22]。Luo等[23]研究發現，CPT可抑制肝癌細胞異種移植瘤的生長，且其對肝癌的抗腫瘤機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路后引起的細胞凋亡和自噬有關。黃等[24]的研究發現，CPT能有效抑制胰腺癌細胞的生長和遷移，其作用機制可能與其下調AKT 的表達，并進一步導致胰腺癌細胞生長周期阻滯及抑制EMT過程有關。Zhang等[25]研究發現，CPT通過調節MMP/TIMP系統、PI3K/AKT/mTOR信號和HIF-1α核易位，抑制炎癥和腫瘤血管生成來抑制結腸癌的生長和侵襲。Jin L等[26]研究發現，CPT通過促進TAZ從核向細胞質的易位減弱非小細胞肺癌細胞的干性，揭示其作為非小細胞肺癌輔助治療的可能性。

本研究發現，CPT 能夠抑制人下咽癌細胞FaDu的增殖及遷移能力，且抑制作用呈藥物濃度依賴性增強。通過進一步檢測CPT對PI3K/AKT信號通路核心蛋白AKT 蛋白的影響，結果表明CPT 可明顯抑制總AKT及p-AKT的表達。本研究表明CPT在下咽癌中表現出較好的抗腫瘤活性，其作用機制可能與其下調AKT 的表達，并進一步下調細胞周期蛋白（CDK4 及Cyclin D）及上皮細胞-間充質轉化蛋白（Vimentin）的表達有關。

5 結論

CPT 能明顯抑制人下咽癌細胞FaDu 的增殖及遷移，其抑制作用可能是通過下調PI3K/AKT信號通路核心蛋白AKT蛋白的表達來實現，但其確切的調控機制還需進一步的研究。本研究為CPT 用于下咽癌患者的治療提供了依據，為其作為抗下咽癌藥物的后續開發奠定基礎。