湖北麥區不同輪作模式下小麥赤霉病菌種群結構和毒素化學型分析

劉美玲，劉 悅，陳婷婷，龔雙軍，史文琦，曾凡松，楊立軍，喻大昭

(湖北省農業科學院植保土肥研究所/農業農村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室/農作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

小麥赤霉病是一種世界范圍內危害極重的流行病害，隨著全球氣溫升高、秸稈還田的普及以及免耕技術的推廣，小麥赤霉病在全球各小麥產區呈迅速擴張趨勢[1]，在近些年份造成小麥嚴重減產、品質下降，且會使感病麥粒分泌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等毒素[2-3]，間接引發食品安全問題。2018年，我國小麥赤霉病發病面積 5.7×106hm2，超過小麥播種總面積的三分之一，其中湖北省發病面積超過40%[3]；2012年，我國小麥赤霉病流行區約發生面積9.3×106hm2[4]。2015 和 2016 兩年全球赤霉病平均造成小麥產量損失7.35×108t，直接經濟損失達1.45億美元[5]。另外，病原菌還能產生多種真菌毒素，危害人畜健康及食品安全[6-7]，因此受到世界相關學者們的廣泛關注。

小麥赤霉病由多種鐮孢菌致病種引起，其中禾谷鐮孢菌(F.graminearumsensu strict)是優勢致病種。禾谷鐮孢菌是一個進化宗系群，早在2008年就被分離和鑒定出24個種的鐮孢菌[8]。致病種在不同地域麥區之間差異明顯，華北、西北、黃淮流域及其以北麥區F.graminearum為優勢致病種群；而長江中下游麥區F.asiaticum為優勢致病種群[9-11]。赤霉病菌主要產生B型單端孢霉烯族(trichothecene)毒素，此類毒素主要分為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)兩類真菌毒素，其中DON又可進一步細分為3-ADON、15-ADON兩種衍生物毒素[12]。溫、濕度等氣象條件、多樣的種植方式在較大程度上影響著病原菌的地理分布[13]；此外，不同的小麥栽培品種和不同的輪作制度也與病原菌類型有著很大的關系[14]，如Lee等[15-16]研究表明，在朝鮮水稻-小麥輪作區的赤霉病菌以F.asiaticum為主，而玉米-小麥輪作區的赤霉病菌以F.graminearum為主。研究發現，小麥-玉米輪作田赤霉病發生較重，而將輪作植物由玉米換成大豆后赤霉病感染率顯著下降；在常年種植非禾谷類農作物的大田中很難分離到赤霉病菌[17]。考慮到湖北小麥主產區以玉-麥輪作和稻-麥輪作為主，本研究擬在湖北襄陽主產麥區的襄州區和棗陽市分別選擇長期水稻-小麥和玉米-小麥輪作田塊取樣分析，以明確不同輪作方式對小麥赤霉病菌種群和毒素化學類型的影響，為赤霉病的大田防治決策提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和分離

2019和2020 兩年度從湖北省襄陽市襄州區和棗陽市不同輪作模式田塊于小麥灌漿期分別采集小麥赤霉病病穗樣品，其中，采樣點襄州區原種場、牛首鎮以及棗陽市太平鎮為玉-麥輪作田塊，襄州區張家集鎮何崗村、棗陽市吳店鎮蔣莊村為稻-麥輪作田塊。每個采樣田塊棋盤式隨機取 15～20株具有明顯發病癥狀的小麥穗，用信封袋裝好編號。采用組織分離法進行分離，即將小麥病穗的病健交接處剪成1～2 cm的短節，先置于2%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒1 min，再用75%酒精消毒1 min,無菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干水分后將樣品置于含100 ug·mL-1硫酸鏈霉素的PDA培養基中，置于25 ℃培養箱培養3 d，獲得各分離物。

1.2 分離物形態學初步鑒定、菌株單孢純化與 保存

鐮孢菌的初步形態學鑒定是以分離物在PDA培養基上菌落顏色和形態以及在綠豆培養基中產生的分生孢子形態等為依據[18-19]。在PDA培養基上培養1 d后有綿白色細長菌絲，3 d后PDA培養基出現淺洋紅色，7 d后菌絲長滿整個培養基，培養基顏色變為紫紅色，顏色呈輻射狀由深到淺，即可初步判定其為鐮孢菌。將這些初步鑒定為鐮孢菌的分離物，用直徑1 cm的打孔器打菌餅接種至5%的綠豆汁培養基中，在恒溫搖床中26 ℃、180 r·min-1培養3 d；將鏡檢能觀察到大量中間有隔的鐮刀狀分生孢子稀釋到1×103個·mL-1；將3%水瓊脂用滅菌刀片分割成邊長3 mm的小塊，點接1 μL孢子液，在顯微鏡16×10視野下觀察，挑取只有一個孢子的水瓊脂塊。將該瓊脂塊移動到PDA培養基中， 25 ℃培養3 d后，挑取菌絲塊于50%甘油中，-70 ℃長期保存。

1.3 鐮孢菌致病種的分子鑒定

采用DNA試劑盒(Omega Bio-Tek公司)提取篩選的鐮孢菌株基因組DNA。DNA用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，放于-20 ℃冰箱中保存備用。利用引物 Fg16F/R對提取物進行PCR擴增，其中F.asiaticum擴增產物片段大小為 500 bp，F.graminearum擴增產物片段大小為 400 bp[20]。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min；10 ℃ +∞。試驗用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具體引物序列見表1。擴增產物均用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測、照相。

1.4 鐮孢菌毒素化學型的鑒定

采用引物3CON、3NA、3D15A和 3D3A進行PCR檢測，根據帶型大小區分所產毒素的類型[28]，其中，產 NIV毒素擴增產物為 840 bp，產 15ADON 毒素為 610 bp，產 3ADON 毒素為 243 bp(圖2)。PCR反應程序：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min，10 ℃ +∞。試驗用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具體引物序列見表1。

表1 擴增引物Table 1 Primers for PCR amplification

2 結果與分析

2.1 不同輪作模式下小麥赤霉病菌種群結構

通過形態學和分子生物學鑒定，共從湖北省襄陽市、棗陽市稻-麥輪作田和玉-麥輪作田分離出191株赤霉病菌，通過PCR對其進行分類，結果見表2。其中，玉-麥輪作田共分離菌株62株，F.graminearum占62.90%，F.asiaticum占37.10%；稻-麥輪作田分離菌株129株，F.graminearum占6.98%，F.asiaticum占93.02%。說明玉-麥輪作田優勢種是F.graminearum，稻-麥輪作田優勢種是F.asiaticum。

表2 供試菌株的來源、種群類型Table 2 Sources and species composition of the tested strains

M: 100 bp DNA ladder; 1～5:分離菌株 Isolated strains

2.2 不同輪作模式下小麥赤霉病鐮孢菌致病種與毒素化學型的關系

通過PCR檢測NIV、3-AcDON、15-AcDON結果如表3所示。191株赤霉病菌中,11株產生NIV毒素，180株產生DON毒素;兩種輪作模式均以產生DON毒素為主。稻-麥輪作田中，共檢測到120個菌株產DON毒素，其中87.50%產生3-AcDON毒素，12.50%產生15-AcDON毒素。玉-麥輪作田中，共檢測到60個菌株產DON毒素，其中31.67%產生3-AcDON毒素，68.33%產生15-AcDON毒素。稻-麥輪作田中，F.asiaticum以3-AcDON為主，占比86.67%；F.graminearum以15-AcDON為主，占比66.67%。玉麥輪作田中，F.asiaticum主要產生3-AcDON，占65.22%；F.graminearum既可能產生15-AcDON又可能產生3-AcDON。

表3 191株鐮孢菌菌的來源、類型及其產毒素類型Table 3 Source of the 191 Fusarium，species and toxin chemical types strains

M: DL2000;1～10:產毒素樣品 Samples of toxigenic

3 討 論

多種鐮孢菌可以引起小麥赤霉病，赤霉病菌優勢種因地區及不同輪作方式而異。Qu等[21]和Zhang等[22]研究認為，赤霉病菌種群分布受氣溫、緯度影響，年平均氣溫低于15 ℃緯度高的涼爽省份以F.graminearum種群占比較大，而年平均氣溫高于15 ℃緯度低的省份以F.asiaticum種群占比較大。然而，溫度并不是影響小麥赤霉病菌種群分布的決定因素，小麥的不同輪作方式對鐮孢菌種群的分布影響更大。方興州等[23]和Lee等[24]的研究表明，水稻-小麥輪作區F.asiaticum是主要的優勢群體，玉米-小麥輪作區F.graminearum是主要的優勢群體。盧麗斌[25]研究發現，安徽省同一經緯度、同一氣候條件下，不同前茬作物對對鐮孢菌種群具有明顯影響。本研究中，襄陽和棗陽所選擇的水稻-小麥和玉米-小麥輪作區的取樣點分別只有10 km左右距離，平均氣溫、緯度相差不大，發現在玉米-小麥輪作區，鐮孢菌分離株中F.graminearum的占比為66.67%，在水稻-小麥輪作區，鐮孢菌分離株中F.asiaticum占比高達90%以上。與盧麗斌[25]結論一致。不同輪作方式對赤霉病菌優勢種的影響可能與病原菌對前茬作物的偏好性有關。F.graminearum相對于鐮孢菌的其他種對玉米具有寄主偏好性，稻茬對F.asiaticum具有一定的選擇作用[26]。本研究結果表明，湖北省小麥赤霉病菌F.asiaticum和F.graminearum的分布與種植模式顯著相關。

小麥赤霉病不僅影響其產量，更重要的是染病麥粒含有多種赤霉毒素，危害人畜健康，引發糧食安全問題。在一年一熟的水稻種植區，F.asiaticum主要產生NIV毒素[27-28]。在本研究中，產生毒素的差異可能是小麥對產生3-AcDON毒素的F.asiaticum選擇而造成。我國長江中下游麥區是世界上唯一的一年兩熟大范圍稻-麥輪作區，赤霉病菌種群經過了水稻和小麥的選擇，產生3-AcDON毒素的F.asiaticum在水稻和小麥上適應性強逐漸成為優勢種，而一年一熟的水稻種植區沒有小麥選擇的壓力，NIV又對水稻具有偏好性，因而成為優勢種[26，29]。本研究中，湖北稻-麥輪作區F.asiaticum以產生3-AcDON毒素為主，僅檢測到少量的NIV菌株，這與前人報道結論一致[10-11]，玉-麥輪作區15-AcDON毒素比例的上升與分離到的F.graminearum菌株上升有關。報道楊美欣[29]，產DON(3ADON和15ADON)的F.g和F.a菌株致病力要高于產 NIV的F.a菌株，這也說明湖北省相對于四川省小麥赤霉病重發的一個原因。本研究認為，湖北小麥赤霉病菌的種群組成與毒素化學型存在一定的相關性。除受溫度、不同輪作模式等影響之外，不同生態區赤霉病菌毒素化學型的分布是否還受土壤、地質等其他因素影響尚需進一步研究。