我國人群有機磷阻燃劑暴露評估及其健康風險

張曉華，趙繁榮，胡建英

地表過程分析與模擬教育部重點實驗室，北京大學城市與環境學院，北京 100871

從產量和用量來看，阻燃劑已經成為次于增塑劑的第二大塑料助劑，而就主要種類而言，有機溴系阻燃劑因其持久的、生物蓄積性而在全球范圍被逐步限制使用與淘汰，作為其替代品的有機磷阻燃劑(OPFRs)使用量正不斷增加。人們日常生活中頻繁接觸的紡織品、電器外殼、PVC材料、地板涂蠟及食品包裝中，都有有機磷阻燃劑添加。由于該類物質通常是以物理混合而非化學鍵合的方式添加到聚合物材料中，因此很容易通過揮發、浸出、磨損和溶解釋放到周圍環境當中?，F有研究已經報道了在室內空氣及灰塵、飲用水和土壤[1-5]等多種環境介質中檢出有機磷阻燃劑。在人體內，頭發、指甲、母乳、尿液、血液，甚至在孕婦蛻膜和胚胎絨毛樣品中均檢測到了機磷阻燃劑或其代謝產物[6-9]，由于其廣泛的人群暴露，該類物質導致的健康風險已經引起了關注[10]。

已有研究表明，有機磷阻燃劑具有ER、AR和PPARγ等多種核受體活性，干擾生物體內分泌系統，引起代謝紊亂[11-14]。在室內灰塵樣品中，通過非靶向篩選鑒定出了具有肝X受體(LXR)拮抗活性的磷酸三苯酯(triphenyl phosphate, TPHP)與2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-ethylhexyl diphenyl phosphate, EHDPP)2種有機磷阻燃劑[15]。LXR在轉錄調控脂質代謝中起重要作用，脂質組學分析表明，TPHP暴露會下調巨噬細胞中多不飽和脂質的水平，并誘發內質網應激和炎癥反應，從而加劇代謝功能障礙，增加發生高脂血癥等心血管疾病的風險[16]。膽固醇是心腦血管疾病的主要風險因子之一，血液總膽固醇升高目前已經作為一個重要的生理指標用于診斷高血脂癥的發生[17]，同時也是中國近幾十年來心腦血管疾病發病率持續升高的主要原因[18]。2012—2015年對于全國29 678名超過35歲人群的抽樣調查顯示，全國年齡≥35歲人群中，有7.5%出現血液總膽固醇濃度異常[19]。流行病學研究發現，人體尿液中EHDPP與TPHP的羥基代謝產物2-乙基-5-羥基己基二苯基磷酸酯(5-OH-EHDPP)及4-羥基苯基二苯基磷酸酯(4-OH-TPHP)濃度與人體總膽固醇(TC)呈現顯著正相關關系[20]，該研究為我們在人群水平上評價有機磷阻燃劑暴露導致的人群健康風險提供了重要的毒性數據。

為評估有機磷阻燃劑的暴露水平及健康風險，本研究以11種有機磷酸酯代謝產物為對象物質，檢測了全國8個城市600名研究對象尿液中代謝產物濃度，通過歸一化處理計算了反映所有個體的濃度水平。結合流行病學調查數據，評估了我國人群EHDPP和TPHP這2種有機磷酸酯暴露導致血液總膽固醇升高的風險。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 尿液樣品收集

人群尿液樣品采集自全國8個城市(哈爾濱市、南京市、上海市、沈陽市、深圳市、無錫市、鄭州市和株洲市)的居民。以隨機抽樣方式從當地普通人群中招募研究對象。研究對象需要滿足以下條件：(1)在當地居住一年以上；(2)女性研究對象未處于懷孕狀態；(3)沒有嚴重的心血管疾病或糖尿病等代謝相關疾病。對于已招募的研究對象，在相近時間點采集空腹晨尿樣品，存放于40 mL棕色玻璃樣品瓶中，運輸全程使用干冰保持低溫，隨后置于-20 ℃、冰箱冷凍保存。

在知情同意及調查資料保密的前提下，對研究對象的基本資料進行了問卷調查。主要內容包括年齡、身高體質量指數(BMI)、房屋建筑年限、家庭月收入、所從事職業、飲酒及吸煙情況等可能影響暴露水平的相關因素，從而為排除可能存在的濃度異常值提供參考依據。

1.2 材料、試劑與標準品

本研究的目標物質包括11種有機磷酸酯阻燃劑代謝產物：磷酸二苯酯(DPHP)、磷酸二丁酯(DnBP)、二對甲苯基磷酸酯(DCrP)、磷酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、磷酸二(2-丁氧基乙基)酯(BBOEP)、磷酸二(1,3-二氯異丙基)酯(BDCIPP)、磷酸二(2-氯乙基)酯(BCEP)、磷酸二(1-氯-2-丙基)酯(BCIPP)、4-羥基苯基二苯基磷酸酯(4-OH-TPHP)、2-乙基-5-羥基己基二苯基磷酸酯(5-OH-EHDPP)、2-乙基-3-羥基己基二苯基磷酸酯(3-OH-EHDPP)。DPHP和DnBP的分析標樣購自TCI公司(東京，日本)。DCrP、DEHP、BBOEP、BDCIPP和BCIPP的標樣購于Toronto Research Chemicals公司(多倫多，安大略省，加拿大)。4-OH-TPHP的標樣購于韶光公司(上海，中國)。5-OH-EHDPP、3-OH-EHDPP和BCEP的標樣均為自行合成，純度在95%以上[9]。穩定同位素內標DPHP-d10和BCIPP-d12購自Toronto Research Chemicals公司(多倫多，安大略省，加拿大)。

Oasis WAX(60 mg, 3cc)固相萃取柱(SPE)購自Waters公司(米爾福德，馬薩諸塞州，美國)，LC-MS級甲醇購于Fisher Chemicals公司(新澤西州，美國)；甲酸和乙酸鈉為HPLC級，購自Dikma Technologies公司(加利福尼亞州，美國)；超純水經Milli-Q超純水凈化系統(Millipore公司，貝德福德，馬薩諸塞州，美國)制備(電導率>18.2 Ω·cm-1)。本研究樣品處理過程中未使用任何塑料或橡膠容器；使用鋁箔襯于玻璃瓶蓋內側，以盡量減少樣品的采樣、儲存、運輸和提取過程中可能產生的污染；使用農殘級或LC-MC級有機溶劑、高純氮氣；玻璃器皿均事先于馬弗爐中450 ℃烘烤4 h以上。

1.3 尿液樣品處理

尿液樣品處理參考了文獻方法[21]。由于羥基代謝產物在尿液中存在葡萄糖酸酯結合態和硫酸酯結合態[22-23]，為了同時檢測尿液中二酯代謝產物和羥基代謝產物，本研究尿液樣品處理過程中加入了β-葡萄糖酸酯/芳基硫酸酯酶(Merck KgaA公司，達姆施塔特，德國)，用以酶解結合態代謝產物。

尿液樣品提前一晚置于冰上解凍，取0.5 mL解凍后的尿液，加入25 ng·mL-1的DPHP-d10內標20 μL，并與0.5 mLβ-葡萄糖酸酯/芳基硫酸酯酶解緩沖液(10 mg·mL-1水解酶，0.1 mol·L-1乙酸鈉緩沖液)混合，置于37 °C恒溫培養箱中酶解2 h。隨后用WAX SPE小柱對樣品進行富集凈化，具體步驟為：用6 mL含2%(V∶V)氨水的甲醇溶液、4 mL甲醇和2 mL乙酸鈉緩沖液(0.1 mol·L-1, pH=4.5)活化WAX SPE小柱，隨后取酶解完成的尿樣進行上樣，上樣后的SPE小柱用2 mL含30%(V∶V)甲醇的乙酸鈉緩沖溶液混合液淋洗，并用高純氮氣吹干。使用2 mL含2%(V∶V)氨水的甲醇溶液進行洗脫，洗脫液使用高純氮氣緩吹濃縮至近干，隨后用100 μL甲醇重溶，處理后的樣品經0.2 μm的針式濾器(Waters)過濾后，用于UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器分析方法

目標物質的分析使用UltiMate 3000 UPLC儀器(Thermo Fisher Scientific公司，圣何塞，加利福尼亞州，美國)與TSQ Quantiva(Thermo Fisher Scientific公司，圣何塞，加利福尼亞州，美國)三重四級桿質譜儀聯用完成。使用ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)進行目標物質分離，柱溫保持40 ℃。流動相A為甲醇，流動相B為10 mmol·L-1乙酸銨水溶液。采用線性梯度淋洗，流動相A的比例在1 min內從10%線性升高到50%，在6.5 min時升至75%，在10 min時升至100%，保持3.5 min后，恢復初始流動相比例平衡2 min。流動相流速為300 μL·min-1，進樣量為5 μL。

質譜使用電噴霧離子源(ESI)，所有目標物質都采用正離子模式，采用多選擇反應監測轉換模式(SRM)。ESI噴霧電壓為3 kV，毛細管溫度保持在320 ℃，氮氣作為鞘氣(40 Arb)和輔助氣體(15 Arb)，脫溶劑氣溫度保持在320 ℃。氬氣作為碰撞氣體(1.5 mTorr=0.1995 Pa)碰撞誘導解離。目標分析物的質譜參數是通過標準品溶液直接進樣來獲取較高目標化合物離子峰和碎片離子豐度，對質譜參數進行優化調整獲得的。

1.5 質量控制與定量

本研究在定性識別樣品中目標物質時考慮2個因素：與標準樣品相比，保留時間相差20%以內；目標對象物質的定性、定量離子面積比相差20%之內。所有目標物質使用最高豐度或背景干擾最少的SRM轉換離子對定量。校正曲線使用0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100和500 ng·mL-1濃度序列的標準樣品溶液獲得，每個目標物校準曲線的線性回歸系數均>0.995。

通過在尿液樣品基質中分別加入1、10和100 ng·mL-1(n=6) 3個濃度的目標分析物進行加標實驗(表3)。低、中、高濃度組的加標回收率分別為76%～102%(RSD: 2%～12%)、73%～105% (RSD: 1%～7%)和79%～103% (RSD: 1%～7%)，基質效應為-12.3%～4.1%。為了保證定性、定量分析的準確性，所有的分析流程進行了準確性、精度、重復性、線性、過程空白的檢查。在分析尿樣時，每10份樣品間加入一個程序空白。在空白樣品中檢測到DPHP與DnBP具有背景值，分別為(0.028±0.002) ng·mL-1與(0.173±0.023) ng·mL-1。對于這2個物質，最終濃度扣除空白背景值，以空白背景值標準偏差的3倍作為檢出限(LODs)，以標準偏差的10倍作為定量限(LOQs)；未檢出空白的物質以實際樣品的色譜峰信噪比為3時的濃度作為LODs，以信噪比為10的濃度作為LOQs。目標物質的LODs范圍為0.006～0.507 ng·mL-1，LOQs范圍為0.02～1.69 ng·mL-1。用氘代同位素內標法對目標物質進行定量，DPHP-d10用于DPHP、DCrP、DnBP、DEHP和BBOEP的定量，BCIPP-d12用于BCIPP、BCEP和BDCIPP的定量，TPHP-d15用于5-OH-EHDPP、3-OH-EHDPP和4-OH-TPHP的定量。

1.6 基準劑量(benchmark dose, BMD)的計算

對于因變量為連續變量的流行病學調查結果，采用美國環境保護局建議的BMD計算方法[24-25]，計算公式如下：

(1)

式中：Φ-1為標準正態分布累積概率函數的反函數，BMR(benchmark response)是基準響應(%)，即達到BMD的平均響應變化百分比，P(0)為背景發生率(%)，即為在非暴露人群中的異常發生概率。在之前的研究中，普遍采用5%作為背景發生率[26-30]，本研究也采用了5%的背景發生率。β為線性回歸的斜率，已有流行病學調查結果顯示，人群尿液中5-OH-EHDPP與4-OH-TPHP的濃度與血液總膽固醇(total cholesterol, TC)濃度呈顯著正相關，與5-OH-EHDPP和4-OH-TPHP濃度回歸的斜率β及95%上下限如表1所示[20]。σ是線性回歸因變量的標準偏差，TC的σ為2.60[20]。本研究采用BMD的95%置信度水平下限值(BMDL)作為血液總膽固醇升高的基準劑量，當P(0)及BMR均確定時，公式中其余變量均為定值，將β的95%置信區間上限值代入式(1)，即可得到BMDL。

表1 尿液有機磷阻燃劑(OPFRs)代謝產物濃度與總膽固醇(TC)的多元回歸結果Table 1 Multiple regression results of urine organophosphate flame retardants (OPFRs) metabolites concentration and total cholesterol (TC) concentration

在流行病學研究中，較少發生10%的附加風險的情況[31]。美國環境保護局基于流行病學調查的BMD研究，建議BMR為1%～5%[32]。對國家毒理學計劃(National Toxicology Program, NTP)58種化合物、6個毒性終點數據的分析發現，對于因變量為連續變量的毒性數據，BMDL05更加接近無可見有害作用水平(NOAEL)[33]，歐洲食品安全局(EFSA)因此建議將BMR設定為5%[34]，在以TC升高為終點制定全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)與全氟辛酸(PFOA)的健康指導值時，EFSA也采用了BMDL5作為基準值[35]。鑒于上述理由，本研究中采用BMR為5%計算了BMDL5作為基準值。

1.7 健康風險評價

使用ProUCL Version 4.00.02軟件(美國環境保護局，2007)對尿液中有機磷酸酯代謝產物濃度數據進行未檢出值處理，處理后的數據使用SPSS軟件對其分布進行檢驗。對于尿液濃度呈現對數正態分布的物質，使用Crystal Ball v7.3.1軟件中的蒙特卡洛方法進行模擬計算，得到8個城市中各物質濃度分布的幾何均值(GM)及幾何標準差(GSD)。通過式(2)和式(3)，將8個城市的居民尿液的OPFRs代謝產物濃度分布進行歸一化處理[36]，計算得到全國人群尿液中OPFRs代謝產物濃度。

(2)

(3)

式中：Cbj為各城市尿液中OPFRs的代謝產物濃度的幾何均值(ng·mL-1)，SD為相應的幾何標準差(ng·mL-1)，n為各城市人口數量(人)。通過計算8個城市人群及全國人群當中有機磷酸酯尿液濃度高于BMDL5的人口比例，我們可以對有機磷酸酯暴露導致的健康風險進行評價。

2 結果(Results)

2.1 尿液樣品有機磷酸酯代謝產物濃度水平及組成特征

在8個城市的600名居民中，所有11種目標OPFRs代謝產物均在尿液樣品中檢出(表2)。EHDPP的羥基代謝產物5-OH-EHDPP和3-OH-EHDPP以及TPHP的羥基代謝產物4-OH-TPHP檢出率分別為72%、28%和80%，二酯代謝產物BCEP、BDCIPP、DnBP、DPHP、DCrP、DEHP、BBOEP和BCIPP的檢出率分別為83%、73%、66%、63%、57%、43%、32%和5%。

表2 尿液樣本中OPFRs代謝產物檢出率及濃度Table 2 Detection frequency and concentration of OPFRs metabolites in urine samples

在11種OPFRs代謝產物中，BCEP是檢出濃度最高的物質，這與之前中國華南地區兒童中采集的411個尿液樣本中有機磷酸酯代謝產物的監測結果一致[37]。BCEP的中值濃度為2.89 ng·mL-1，比2015年華南地區兒童尿液濃度1.04 ng·mL-1[37]高出1倍。DnBP的檢出濃度次之，中值濃度為0.84 ng·mL-1，比文獻中報道的中國華南地區兒童尿液濃度(中值濃度為0.12 ng·mL-1)[37]和美國加利福尼亞州的人群尿液濃度(中值濃度為0.11 ng·mL-1)[38]高出8倍，比2017年中國13個城市的人類尿液濃度0.29 ng·mL-1[39]高近3倍。濃度排在第三的是DPHP，中值濃度為0.34 ng·mL-1，濃度與文獻報道的中國13個城市的人類尿液濃度0.30 ng·mL-1相當[39]，低于美國加利福尼亞州的人群尿液中DPHP的濃度0.44 ng·mL-1[38]和人工授精(IVF)孕婦的尿液濃度0.75 ng·mL-1[40]，遠低于美國北卡羅來納州的1.6 ng·mL-1[41]，高于美國馬薩諸塞州男性尿液濃度0.27 ng·mL-1[42]。BDCIPP中值濃度為0.20 ng·mL-1，與美國馬薩諸塞州男性的尿液濃度0.12 ng·mL-1[42]和中國13個城市的人類尿液濃度0.15 ng·mL-1[39]相近，低于美國北卡羅來納州的1.1 ng·mL-1[41]，以及美國加利福尼亞州的人群尿液濃度0.46 ng·mL-1[38]。DCrP的中值濃度為0.12 ng·mL-1，其余物質的中值濃度均低于LOQ。

對比EDHPP的2種羥基代謝產物，5-OH-EHDPP的平均濃度(0.09±0.52) ng·mL-1,均高于3-OH-EHDPP的(0.06±0.66) ng·mL-1，說明EHDPP在人體內主要代謝為5-OH-EHDPP。TPHP的羥基代謝產物4-OH-TPHP的平均濃度為(3.01±2.12) ng·mL-1，中值濃度為0.12 ng·mL-1。4-OH-TPHP濃度范圍較大(

不同城市的OPFRs尿液代謝產物的濃度總和相差較小(圖1)。其中，哈爾濱市居民尿液總濃度最高，濃度中值為26.28 ng·mL-1，深圳市居民尿液代謝產物總濃度最低，濃度中值為5.80 ng·mL-1。其余城市的代謝產物總濃度中值分別為：鄭州市22.78 ng·mL-1，南京市14.35 ng·mL-1，上海市6.82 ng·mL-1，沈陽市6.49 ng·mL-1，無錫市8.47 ng·mL-1，株洲市8.96 ng·mL-1。

圖1 全國8個城市居民尿液OPFRs代謝產物總濃度Fig. 1 Total concentrations of urinary OPFRs metabolites among residents of 8 cities in China

不同城市尿液物質組成有明顯的差異。哈爾濱市、南京市、無錫市、鄭州市、株洲市、沈陽市及上海市居民尿液中，含氯的代謝產物BCEP為最主要的檢出物質，占總濃度的比例分別為93%、89%、85%、83%、76%、67%和59%。烷基OPFRs的代謝產物DnBP在哈爾濱市、南京市、無錫市、鄭州市、株洲市及沈陽市這些城市居民尿液中的濃度排在第二，占總濃度的比例分別為3.5%、6.1%、5.8%、12%、12%和16%；上海市居民尿液中DEHP的濃度排在第二位，占總濃度的17%。而在深圳市居民尿液中，最主要的是烷基的DnBP，占OPFRs代謝物總濃度的42%，芳香類有機磷酸酯的代謝產物DPHP(21%)、DCrP(18%)以及4-OH-TPHP(8%)在深圳市人群尿液當中也占據了較大的比例(圖2)。

圖2 全國8個城市居民尿液中OPFRs代謝產物組成Fig. 2 Profile of OPFRs metabolites in urine of residents from 8 cities in China

2.2 全國人群尿液有機磷酸酯代謝產物濃度水平

未檢出率較高的數據集(如未檢出率>40%)，使用參數化方法對未檢出值進行處理后，所得到的分布假設難以驗證其真偽[43]。因此，本研究僅對于檢出率高于60%的6種有機磷酸酯代謝產物5-OH-EHDPP、4-OH-TPHP、BCEP、BDCIPP、DnBP及DPHP進行未檢出值處理及分布檢驗。檢驗結果顯示，各個城市居民尿液中6種有機磷酸酯濃度符合對數正態分布(表3)。歸一化計算結果顯示，全國人群尿液中5-OH-EHDPP、4-OH-TPHP、BCEP、BDCIPP、DnBP及DPHP的濃度分別為(0.03±2.75)、(0.08±2.77)、(4.78±2.77)、(0.12±2.77)、(0.83±2.77)和(0.25±2.75) ng·mL-1。BCEP在全國人群當中平均濃度最高，5-OH-EHDPP平均濃度最低。

表3 8個城市及全國居民尿液OPFRs代謝產物濃度水平分布Table 3 Urinary concentration of OPFRs metabolites in 8 cities and across the country

2.3 BMD估計值及人群風險評價

根據式(1)，計算得到5-OH-EHDPP和4-OH-TPHP以TC升高為終點的BMDL5值分別為0.93 ng·mL-1和0.21 ng·mL-1，5-OH-EHDPP的BMDL5低于4-OH-TPHP。

對8個城市尿液濃度分布進行歸一化處理，得到全國5-OH-EHDPP與4-OH-TPHP濃度分布的幾何均值與幾何標準差。我們通過蒙特卡洛模擬分別生成了與8個城市人口數量及全國總人口數量相同的呈對數正態分布的隨機濃度數據，并統計了尿液濃度超出BMDL5的概率(表4)。

表4 8個城市及全國居民膽固醇升高風險Table 4 Probability of elevated cholesterol in 8 cities and in China

在8個城市當中，深圳市的EHDPP風險最高。深圳市的人口中，有18%的人尿液5-OH-EHDPP濃度超過BMDL5，面臨TC上升的風險。南京市的風險次之，有14%的人口的尿液5-OH-EHDPP濃度超過BMDL5。排在第3位的是無錫市，TC上升概率為11%。上海市EHDPP暴露的風險最低，只有0.41%的人口面臨TC升高的風險。在全國范圍當中，共有2.7%的人口尿液濃度高于BMDL5。

對于TPHP暴露，無錫市呈現最高的風險水平，其次是深圳市。2個城市尿液4-OH-TPHP濃度超出BMDL5的人口比例分別為17%和16%，風險最低的地區是哈爾濱市，有0.98%的尿液4-OH-TPHP濃度超過了BMDL5，其余城市的超出比例相對較低，范圍在0.98%～5.9%之間。全國范圍內，僅有0.80%的人口尿液濃度超過BMDL5。

3 討論(Discussion)

通過全國8個城市的尿液數據調查，揭示了全國不同地區人群的有機磷酸酯內暴露水平及組成特征，并估算得到了6種有機磷酸酯代謝產物的全國人群尿液濃度。有機磷酸酯代謝產物尿液濃度和組成在不同城市人群中差異較大，呈現顯著的區域差異，如深圳市的芳香類有機磷酸酯TPHP、TCrP與其他地區相比呈現出較高的暴露水平。在本研究的基礎上，不同地區環境介質中的有機磷酸酯污染水平及人體主要暴露來源仍有待進一步細致的調查與分析，從而更具有針對性地避免有機磷阻燃劑暴露所導致的人群健康風險。

芳香類有機磷酸酯在人體中會被快速降解代謝為磷酸二酯類化合物，因此在尿液中很難檢出有機磷酸酯本身[44]。目前，以尿液中芳香類有機磷酸酯代謝物作為生物標記物對人群進行內暴露評價是主要的評價方法[41-42]。但以往以二酯類代謝產物為標志物的人群暴露研究中，存在一些代謝產物非特異性指示有機磷酸酯暴露的問題。如大多數研究中常用DPHP指示TPHP的暴露，但是EHDPP、TPHP以及間苯二酚雙(二苯基)磷酸酯(RDP)都有共同的代謝產物DPHP[22-23]，DPHP并不能特異性指示TPHP的暴露水平。已有研究也證明，羥基化代謝產物是評估EHDPP、TPHP暴露的更加穩定、可靠的特異性生物標志物[9]。本研究中，5-OH-EHDPP與4-OH-TPHP的中值濃度雖然均低于以往研究中常用作TPHP標記物的DPHP，但兩者的檢出率均高于DPHP，表明羥基代謝產物不但特異性指示TPHP和EHDPP的暴露，而且是更加靈敏的芳香類有機磷酸酯暴露標志物。根據已有的流行病學調查數據，本研究計算得到了以血液總膽固醇水平升高5%為終點的2種羥基代謝產物基準濃度，結果表明，EHDPP與TPHP暴露分別導致了2.72%與0.80%的全國人群面臨血液總膽固醇升高的風險，有機磷酸酯暴露對于普通人群血脂濃度的影響應當進一步關注與研究。