YKL-40、RSK4、cyclinD1在結腸癌中的表達及意義

陽飛良 劉翔 丁 彭瓊

(萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院普外科，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

結腸癌屬于消化系統(tǒng)腫瘤中常見惡性腫瘤之一，由于結腸癌早期癥狀不明顯導致患者治療效果較差，但結腸癌致病機制尚未完全闡明〔1，2〕。血清腫瘤標志物具有高效、簡便、無創(chuàng)等優(yōu)點，因而基于結腸癌的分子機制探尋結腸癌早期診斷及預后的分子標志物具有重要意義。人軟骨糖蛋白(YKL)-40在結腸癌組織中的表達水平顯著升高，其高表達量可能與結腸癌發(fā)生及發(fā)展密切相關〔3〕。細胞周期蛋白(cyclin)D1在結腸癌組織中的表達水平明顯升高，其高表達量與患者臨床分期、淋巴結轉移等臨床病理特征有關〔4〕。核糖體S6蛋白激酶(RSK)4蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率顯著降低，并可能發(fā)揮抑癌基因作用〔5〕。但YKL-40、RSK4、cyclinD1在結腸癌患者血清中的表達水平及其與患者預后的相關性研究相對較少。本研究通過觀察結腸癌患者血清及癌組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1表達水平并分析其相關性，分析其表達與患者臨床病理特征及預后的關系，進一步探討其對結腸癌的診斷價值，為結腸癌的早期診斷、治療及預后評估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年3月至2016年3月于萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院進行治療的86例結腸癌患者為研究對象，所有患者經(jīng)病理證實為結腸癌，男56例，女30例，平均年齡(60.12±7.32)歲。收集所有患者臨床病理參數(shù)，35例無轉移，51例有轉移；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期51例；分化程度：高分化26例，中分化21例，低分化39例；左半結腸43例，右半結腸43例。同時選取于萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院健康體檢志愿者56例為對照組，男36例，女20例，平均年齡(62.11±6.09)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有結腸癌患者于術中切取結腸癌組織及其相應癌旁組織(≥5 cm)，術后置于-80℃超低溫冰箱保存。納入標準：結腸癌患者均經(jīng)過手術病理證實；術前未接受放化療。排除標準：合并其他惡性腫瘤；心、肝等重要器官嚴重損傷；生存期不超過6個月；臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 兔抗人YKL-40、RSK4、cyclinD1單克隆單抗購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG購自于美國R&D公司；YKL-40、RSK4、cyclinD1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RNA提取試劑盒購自北京生化科技有限公司；反轉錄試劑盒與實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒購自美國Thermo scientific公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。BX51光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2qRT-PCR檢測結腸癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達水平 所有患者術前2 d抽取空腹靜脈血3 ml置于不含抗凝劑的試管內(nèi)，4℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清液，置于4℃冰箱內(nèi)保存待測。采用Trizol法從血清中提取RNA，核酸測定儀測定RNA含量，根據(jù)反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。YKL-40引物序列為：上游：5'-GAGGATGGAACTTTGGGTCTC-3'，下游：5'-TCATTTCCTTGATTAGGGTGGT-3'；RSK4引物序列為：上游：5'-AATGCTACCATTCGCTCCTCA-3'，下游：5'-TTACAGGCCAGTTGATGTTCGC-3'；cyclinD1 引物序列為：上游：5'-AGGAACAGAAGTGCGAGGAGG-3'，下游：5'-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGATG-3'；β-actin引物序列為上游：5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'，下游：5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTCCTC-3'。qRT-PCR反應體系共20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6 μl；反應條件：95℃ 預變性3 min；95℃ 30 s、60℃ 20 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。YKL-40、RSK4、cyclinD1均以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達水平。

1.2.3免疫組化染色檢測結腸癌組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達率 制備結腸癌組織石蠟切片，經(jīng)不同濃度乙醇脫水，置于檸檬酸鹽溶液內(nèi)，20 min后采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育25 min，PBS清洗，滴加山羊血清(15 min)，加入YKL-40、RSK4、cyclinD1一抗，4℃孵育24 h，PBS清洗，加入二抗，室溫孵育2 h，PBS清洗，滴加DAB顯色液，蘇木素復染，經(jīng)不同濃度乙醇脫水，加入二甲苯，中性樹脂封片，置于顯微鏡下進行觀察。結果判定〔6〕：200倍顯微鏡下觀察陽性染色細胞計算陽性細胞百分比，根據(jù)染色程度：未著色計為0分；淺黃色計為1分；棕黃色計為2分；棕褐色計為3分。按照陽性細胞數(shù)目：陽性細胞數(shù)目<10%計為0分；陽性細胞數(shù)目10%～30%計為1分；陽性細胞數(shù)目31%～60%計為2分；陽性細胞數(shù)目>60%計為3分。取兩組計分之和，評分>2分地為陽性表達，≤2分計為陰性表達。

1.2.4隨訪 結腸癌患者進行3年隨訪，隨訪截止日期為2018年5月，隨訪方式：電話或門診復查，統(tǒng)計患者總生存期(OS)即從隨機開始至因任何原因引起死亡的時間。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件行獨立樣本t檢驗、χ2檢驗、受試者工作特征(ROC)曲線、Pearson相關分析、多因素分析。

2 結 果

2.1結腸癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達水平比較 與對照組相比，結腸癌組血清中YKL-40、cyclinD1 mRNA表達水平均顯著升高(均P<0.001)，而RSK4 mRNA表達水平顯著降低(P<0.001)，見表1。

表1 結腸癌患者血清中YKL-40、RSK4、cyclinD1 mRNA表達水平比較

2.2結腸癌及癌旁組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達率比較 免疫組化組顯示YKL-40、cyclinD1、RSK4染色呈黃色、棕黃色、褐色，見圖1。與癌旁組織相比，結腸癌組織YKL-40、cyclinD1蛋白陽性表達率顯著增強(P<0.05)，RSK4蛋白陽性表達率顯著減弱(P<0.05)，見表2。

圖1 結腸癌組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1蛋白表達(DAB，×200)

表2 結腸癌及癌旁組織中YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達率比較〔n(%)，n=86〕

2.3YKL-40、RSK4、cyclinD1在結腸癌中的表達相關性分析 RSK4表達與YKL-40表達呈負相關(r=-0.333，P=0.002)，RSK4表達與cyclinD1表達呈負相關(r=-0.309，P=0.004)，YKL-40表達與cyclinD1表達呈正相關(r=0.224，P=0.038)，見圖2。

圖2 結腸癌中YKL-40、RSK4、cyclinD1表達的相關性

2.4YKL-40、RSK4、cyclinD1聯(lián)合檢測對結腸癌的診斷價值分析 ROC分析YKL-40、RSK4、cyclinD1對結腸癌的診斷價值，YKL-40表達水平診斷結腸癌的敏感性為62.79%，特異性為57.14%，曲線下面積(AUC)面積為0.783(95%CI：0.706～0.848)；RSK4表達水平診斷結腸癌的敏感性為41.86%，特異性為89.29%，AUC面積為0.605(95%CI：0.520～0.686)；cyclinD1表達水平診斷結腸癌的敏感性為54.65%，特異性為69.64%，AUC面積為0.690(95%CI：0.607～0.765)；聯(lián)合檢測診斷結腸癌的敏感性為94.19%，特異性為98.21%，AUC面積為0.985(95%CI：0.949～0.998)，聯(lián)合檢測診斷敏感性顯著高于單項檢測(P<0.05)，見圖3。

圖3 YKL-40、RSK4、cyclinD1聯(lián)合檢測對結腸癌的診斷價值

2.5YKL-40、RSK4、cyclinD1表達與結腸癌患者臨床病理特征的相關性 YKL-40陽性表達、cyclinD1陽性表達、RSK4陽性表達與浸潤深度、淋巴結轉移、血管浸潤、TNM分期、分化程度相關(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤位置、病理分型、腫瘤直徑、病理類型無相關性(P>0.05)，見表3。

表3 YKL-40、RSK4、cyclinD1陽性表達與結腸癌患者臨床病理特征的相關性〔n(%)〕

2.6YKL-40、RSK4、cyclinD1表達與結腸癌患者預后的相關性分析 Kaplan-Meier曲線顯示，YKL-40、RSK4、cyclinD1均與患者OS密切相關。YKL-40陰性表達組生存率(40.23%)高于陽性表達組(19.88%)，cyclinD1陰性表達組生存率(51.28%)高于陽性表達組(18.76%)，RSK4陽性表達組生存率(43.56%)高于陰性表達組(18.83%)，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖4。

圖4 結腸癌患者YKL-40、RSK4、cyclinD1表達與生存率的關系

2.7影響結腸癌患者預后的Cox回歸分析 將影響結腸癌患者預后的因素進行COX比例風險回歸多因素分析，以浸潤深度、淋巴結轉移、血管浸潤、TNM分期、分化程度、YKL-40表達、RSK4表達、cyclinD1表達為自變量進行分析，結果顯示淋巴結轉移、TNM分期、YKL-40表達、RSK4表達、cyclinD1表達是影響結腸癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響結腸癌患者預后的Cox分析

3 討 論

據(jù)調(diào)查顯示，近年來，結腸癌發(fā)病率逐年增加，隨著現(xiàn)代分子生物學及基因檢測的發(fā)展，越來越多的腫瘤標志物與治療靶點的發(fā)現(xiàn)成為提高結腸癌患者生存率的重點研究方向〔7〕。但結腸癌早期篩查指標的靈敏度及特異度較低導致其診斷效率降低〔8〕。結腸癌發(fā)病機制較為復雜，研究表明基因表達異常可促進結腸癌細胞分化或促進癌癥發(fā)生發(fā)展〔9〕。因此本研究擬探尋結腸癌早期診斷及其預后的獨立預測因子。

YKL-40在卵巢癌等腫瘤組織中呈高表達，并可作為評估患者預后的分子標志物〔10〕。研究表明子宮內(nèi)膜癌組織及血清中YKL-40的表達水平明顯升高，并可作為早期診斷子宮內(nèi)膜癌的重要輔助標志物〔11〕。乳腺癌患者血清中YKL-40的表達水平升高，其高表達量與患者淋巴結轉移密切相關，并可作為判斷乳腺癌患者預后的預測因子〔12〕。與上述研究報道相似，本研究結果提示YKL-40表達水平升高可能促進結腸癌的發(fā)生。研究表明cyclinD1在肺癌組織中呈高表達，并可作為評估肺癌患者預后的參考指標〔13〕。結腸癌發(fā)生發(fā)展與細胞周期失控有關，研究表明cyclinD1在腫瘤組織中呈高表達，其表達量升高可促進細胞周期進展，抑制cyclinD1的表達可降低細胞增殖能力〔14，15〕。本研究結果提示cyclinD1表達水平升高可能促進結腸癌的發(fā)生，YKL-40可能正向調(diào)控cyclinD1表達參與結腸癌的發(fā)生過程。

RSK4在胰腺癌等多種惡性腫瘤中表達下調(diào)，并可參與腫瘤細胞凋亡、遷移及侵襲等過程〔16，17〕。研究表明RSK4還可通過調(diào)控細胞周期影響腫瘤細胞增殖及分化〔18，19〕。相關報道指出RSK4在乳腺癌組織中表達水平降低，并可影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程〔20，21〕。本研究結果提示，YKL-40、cyclinD1在結腸癌中呈高表達，RSK4表達降低，RSK4與YKL-40、cyclinD1在結腸癌中的表達呈負相關，而YKL-40與cyclinD1在結腸癌中的表達呈正相關，YKL-40、cyclinD1、RSK4表達水平與結腸癌患者淋巴結轉移、TNM分期等臨床病理特征密切相關，并可作為評估患者預后的重要指標，聯(lián)合檢測血清YKL-40、cyclinD1、RSK4表達水平可提高結腸癌診斷效率，可為結腸癌的發(fā)病機制及臨床診斷提供參考依據(jù)。但結腸癌中YKL-40、cyclinD1、RSK4之間是否存在轉錄調(diào)控作用還需進一步研究驗證。