抑制PAQR4表達對肝細胞肝癌增殖侵襲的影響及機制

楊達鈞 王劍一 莫嘉強 何軍明

(1廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2廣東省中醫院肝膽胰外科)

原發性肝癌是世界范圍內常見且致命的腫瘤類型，其中最常見的肝癌組織類型是肝細胞肝癌(HCC)〔1〕。HCC每年新發病例超過70萬例，是全球第五大常見腫瘤，是全球腫瘤死亡第三大常見原因，占男性腫瘤相關死亡原因的第二位，而在我國HCC患者新發病例和死亡病例占全球病例的一半〔2，3〕。盡管近年來HCC在手術、化療和靶向等治療策略上不斷改進，但是HCC的死亡率并沒有明顯的改善，患者5年生存率仍然很低〔4〕。目前HCC的發病機制尚未完全明確，越來越多的研究報道探索HCC發病的分子基礎對改進其治療策略至關重要。孕激素和脂聯素受體(PAQR)4是PAQR家族成員之一，該家族中的成員參與調節許多生物過程，包括代謝和腫瘤進展〔5〕。PAQR4在細胞增殖、細胞周期、細胞分化和細胞死亡等生物過程中發揮至關重要的功能〔6〕。關于PAQR4的研究報道較少，但是其在非小細胞肺癌、胃癌和乳腺癌中被報道為癌基因，促進腫瘤增殖和轉移〔7～9〕。PAQR4在HCC中的表達情況及生物學作用未見有報道，本研究旨在探討抑制PAQR4的表達對HCC增殖侵襲的影響及機制。

1 材料與方法

1.1實驗試劑 DMEM-高糖和胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；HCC細胞系HUH-7購于美國ATCC細胞庫；PAQR4 siRNA購于上海銳賽生物技術有限公司；25 cm3培養瓶、6孔板和Boyden小室等購于美國Coring公司；MTS試劑和聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Promega公司；細胞周期檢測試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自中國上海碧云天生物技術有限公司；強效RIPA裂解液購于北京Solarbio公司。

1.2細胞培養及慢病毒感染 HUH-7細胞用含有10%FBS DMEM-高糖培養基培養，放置37℃、5%CO2培養箱中孵育。HUH-7細胞呈對數生長期時，消化收集細胞，以2.0×105個/孔鋪至6孔板中，分為對照組(si-NC組)和PAQR4 siRNA組(si-PAQR4組)，貼壁12 h后，按說明書將NC siRNA和PAQR4 siRNA與轉染試劑Lip2000混勻后加入各組細胞中，放至培養箱中，8～12 h更換新鮮培養基，進行后續實驗。

1.3MTS檢測細胞活性 HUH-7細胞呈對數生長期時，消化收集細胞，以2 000個/孔鋪至96孔板中，每組設置6個復孔，按上述siRNA轉染方法轉染各組細胞，放至培養箱中培養。在轉染細胞24、48、72和96 h時，每孔加入30 μl MTS工作液，37℃培養箱中避光孵育2 h后，全波長掃描儀檢測波長490 nm處的吸光度OD值，OD值代表細胞活性。

1.4平板克隆檢測細胞克隆形成能力 HUH-7細胞呈對數生長期時，消化收集細胞，以300個/孔鋪至6孔板中，分為對照組(si-NC)和PAQR4 siRNA組(si-PAQR4)，每組設置3個復孔，按上述siRNA轉染方法轉染各組細胞，放至培養箱中培養。培養1 w時，將siRNA再次轉染各組細胞，培養至肉眼可見的克隆團形成。棄去培養基，終止培養，PBS洗3次，甲醛固定細胞，結晶紫染色，干燥后計數克隆團的數目。

1.5流式細胞實驗檢測細胞周期 HUH-7細胞呈對數生長期時，消化收集細胞，以2.0×105個/孔鋪至6孔板中，每組設置3個復孔，按上述siRNA轉染方法轉染各組細胞，放至培養箱中培養。培養48 h時，無EDTA的胰酶收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后，加入4℃的75%酒精固定細胞2～24 h。離心去掉酒精，PBS洗2次后，按照周期試劑檢測試劑說明書加入PI染色試劑，37℃避光孵育30 min后，上機進行檢測。

1.6Boyden實驗檢測細胞轉移能力 消化收集轉染NC siRNA和PAQR4 siRNA 48 h的各組HUH-7細胞，無血清培養基洗3次后，1×105個細胞重懸至100 μl 無血清培養基中，加入24孔板中Boyden小室的上室中，下室趨化因子為500 μl的完全培養基，37℃培養箱中培養，直至在顯微鏡下觀察到細胞穿膜掉入下室后終止培養。PBS洗3次后，甲醇固定細胞，結晶紫染色，干燥后將膜取下中性樹膠封片，顯微鏡下計數穿膜細胞數。

1.7Western印跡檢測蛋白表達 消化收集轉染NC siRNA和PAQR4 siRNA 48 h的各組HUH-7細胞，PBS洗3次后，細胞斑塊中加入RIPA裂解液，細胞完全裂解后，4℃、14 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度。蛋白加熱煮沸變性，80 V、150 min進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，350 mA、120 min條件進行濕轉。8%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h進行非特異性蛋白封閉。按說明書加入一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗稀釋液室溫孵育2 h，采用ECL法顯示蛋白條帶。

1.8統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1PAQR4對HCC細胞活性的影響 MTS實驗檢測發現，si-NC組細胞在24、48、72和96 h的OD值分別為(0.57±0.06)、(0.76±0.11)、(0.95±0.11)、(1.37±0.09)，si-PAQR4組細胞在24、48、72和96 h的OD值分別為(0.56±0.05)、(0.65±0.08)、(0.73±0.07)、(0.84±0.08)，與si-NC組細胞活性相比，si-PAQR4組細胞活性顯著降低(均P<0.05)。

2.2PAQR4對HCC細胞平板克隆形成能力的影響 平板克隆形成實驗檢測發現，siRNA轉染HCC細胞HUH-7后，si-NC組細胞克隆團數目〔(112.34±20.15)個〕明顯高于si-PAQR4組〔(45.46±9.22)個，P<0.05〕，見圖1。

圖1 平板克隆形成實驗檢測干擾PAQR4表達對HCC細胞克隆形成能力的影響(結晶紫)

2.3PAQR4對HCC細胞周期的影響 流式細胞儀檢測細胞周期發現，siRNA轉染HCC細胞HUH-7后，si-NC組細胞G0/G1期細胞比例〔(64.33±4.04)%〕明顯低于si-PAQR4組〔(73.01±2.99)%，P<0.05〕。

2.4PAQR4對HCC細胞侵襲能力的影響 Boyden實驗檢測發現，siRNA轉染HCC細胞HUH-7后，si-NC組細胞穿膜細胞數〔(38.67±5.41)個〕明顯高于si-PAQR4組〔(20.33±4.12)個，P<0.05〕，見圖2。

圖2 Boyden檢測干擾PAQR4表達對HCC細胞轉移能力影響(結晶紫，×20)

2.5PAQR4對CyclinD1和基質金屬蛋白酶(MMP)-7的影響 Western印跡檢測發現，siRNA轉染HCC細胞HUH-7后，與si-NC組相比，si-PAQR4組細胞中CyclinD1和MMP-7蛋白表達均降低，見表1和圖3。

表1 兩組轉染后cyclinD1和MMP-7蛋白表達比較

圖3 Western印跡檢測干擾PAQR4表達對CyclinD1和MMP-7蛋白表達的影響

3 討 論

HCC是侵襲性惡性腫瘤，嚴重威脅人類生命健康〔1～3〕。慢性肝炎、肝硬化是導致HCC的重要原因，乙型和丙型肝炎病毒、黃曲霉素等感染是HCC的高危致病因素〔10,11〕。隨著經濟的發展，生活水平的提高，酒精性肝炎和脂肪性肝炎的發病增加促使HCC的發生，使得HCC的發病率居高不下〔12,13〕。HCC早期患者治療主要是局部腫瘤切除和肝臟移植，早期患者1年、3年和5年總生存率相對較高〔14〕。而大多數早期HCC患者無明顯臨床癥狀，往往是出現轉移臨床癥狀而被確診，屬于HCC晚期患者，錯過最佳治療時間。同時肝細胞的再生和血管侵犯能力極強，手術切除后的早期HCC患者容易發生復發和轉移〔15〕，對于晚期和復發HCC患者治療選擇有限，動脈化療栓塞、放化療和靶向治療的聯合治療是主要治療手段，但是具有相對嚴重的副作用〔16〕。靶向藥物索拉菲尼已經明確可以延長晚期HCC患者幾個月的生存時間，因此靶向藥物的研究是治療HCC關鍵突破點。HCC是一種多基因慢性疾病，涉及復雜的基因和信號通路，在HCC發生發展過程中發揮關鍵作用的基因可能是治療HCC的候選靶點。PAQR家族于2005年首次鑒定由7個跨膜通道組成，是一類新發現的膜蛋白受體，含有特有的PFAM-UPF0073結構域，具有高度保守性，其N端朝向細胞質內，C端朝向高爾基體腔內,負責傳遞和調控胞內信號的作用〔5〕。PAQR家族由人類基因組中PAQR1至PAQR11的11個成員組成，每個PAQR蛋白成員在人體中表達的部位和水平不同，相對應的生物學功能也不相同，目前研究的家族成員蛋白是PAQR1、PAQR2、PAQR3、PAQR5和PAQR7〔17〕。PAQR4的研究相對較少，Wu〔7〕報道在非小細胞肺癌患者中PAQR4在癌組織中的表達顯著高于匹配的非癌組織；與正常的乳腺組織相比，PAQR4在82個乳腺癌組織樣本中表達上調〔9〕。PAQR4與HCC的研究未見有報道，本研究顯示與正常肝組織相比，PAQR4在肝癌組織中的表達顯著增加。高表達PAQR4的HCC患者預后較差，提示PAQR4在HCC中高表達，與患者預后不良相關。

研究報道在非小細胞肺癌細胞中過表達PAQR4促進腫瘤細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力，而敲低PAQR4的表達抑制腫瘤細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲能力〔7〕。在胃癌細胞中PAQR4的過表達部分逆轉了miR-370對腫瘤細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化抑制作用〔8〕。RAQR4在HCC細胞中高表達可能促進細胞增殖和侵襲能，具體的作用機制仍需進一步研究。CyclinD1是細胞周期調控的正性因子，作為G0/G1期關鍵蛋白，促使細胞由G0/G1期進入S期進行細胞分裂〔18〕，其表達減少可使細胞阻滯在G0/G1期，細胞增殖抑制，是抗腫瘤治療的重要機制之一〔19,20〕。MMP-2屬于MMPs家族成員之一，通過降解組織基質促進細胞的遷移、侵襲和轉移能力，在腫瘤的侵襲轉移中發揮關鍵作用〔21,22〕，遷移和侵襲是HCC進展和復發的重要步驟，在一定程度上決定了HCC治療的成功與失敗〔23〕。本研究結果表明RAQR4可能通過調控CyclinD1和MMP-2促進HCC細胞增殖和侵襲能力，其深入的作用機制仍需進一步研究。