茯苓抗鼻咽癌的物質基礎及潛在機制的網絡藥理學分析與驗證

程博 范婧瑩 劉潔 蘇芮 周芳亮 黃若茹 王賢文 何迎春

〔摘要〕 目的 運用網絡藥理學預測和實驗驗證茯苓抗鼻咽癌的物質基礎及潛在機制。方法 借助中藥系統藥理學數據庫及分析平臺和BATMAN-TCM數據庫平臺檢索茯苓的化學成分和作用靶點。通過UniProt數據庫查詢靶點對應的基因，使用STRING構建共同靶點互作網絡（PPI）;進而運用Cytoscape 3.7.2軟件構建茯苓活性成分-鼻咽癌-靶點互作網絡圖，通過R軟件編程進行GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析，最后采用MTT和Western blot法進行驗證。結果 茯苓活性成分-鼻咽癌-靶點網絡包含8個活性成分，18個共同靶點，主要富集到4條通路。茯苓的主要抗鼻咽癌活性成分有茯苓酸、茯苓新酸B、常春藤皂甙等，出現頻次較高的靶點有TP53、INS、ESR1、PTGS2等，這些靶點主要涉及細胞因子活性、免疫炎癥系統和腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等生物過程，且靶點主要富集在甲狀腺激素信號通路、雌激素信號通路、PI3K/AKT等信號通路。MTT結果顯示，與對照組比較，茯苓酸組（2.5、5.0、10 μmol·L-1）對CNE2細胞增殖具有明顯抑制作用（P<0.05或P<0.01）。Western blot結果顯示，藥物處理24 h后，與對照組比， 茯苓酸組（5.0 μmol·L-1）降低了CNE2細胞PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白PI3K、p-AKT的表達水平（P<0.05或P<0.01），對AKT的表達無明顯差異性（P>0.05）。結論 茯苓可通過多成分、多靶點和多通路影響鼻咽癌細胞的增殖。且經實驗驗證，茯苓抑制鼻咽癌細胞增殖的作用與抑制PI3K/AKT信號通路的活性相關。

〔關鍵詞〕 網絡藥理學;茯苓;鼻咽癌;分子機制

〔中圖分類號〕R273? ? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.012

Network Pharmacology Analysis and Verification of the Material Basis and Potential

Mechanism of Fuling （Poria） Against Nasopharyngeal Carcinoma

CHENG Bo1，2， FAN Jingying1，2， LIU Jie1， SU Rui1， ZHOU Fangliang1，3， HUANG Ruoru1， WANG Xianwen2，4， HE Yingchun1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To verify the material basis and potential mechanism of Fuling （Poria） against nasopharyngeal carcinoma by network pharmacology prediction and experiment. Methods The chemical constituents and targets of Fuling （Poria） were searched by traditional Chinese medicine system pharmacology （TCMSP） database and BATMAN-TCM database. UniProt database was used to query the genes corresponding to the target， and STRING was used to construct the common target interaction network （PPI）. The PPI of Fuling （Poria） active ingredient-nasopharyngal carcinoma-target was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software. GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were carried out by R software programming. Finally， MTT and Western blot were used to verify the results. Results Fuling （Poria） active component-nasopharyngeal carcinoma-target network contained 8 active components and 18 common targets， mainly enriched into 4 pathways. The main anti nasopharyngeal carcinoma active components Fuling （Poria） were pachymenic acid， pachymenic acid B， ivy saponins， etc. The high frequency targets were TP53， INS， ESR1， PTGS2， etc. These targets were mainly related to cytokine activity， immune inflammatory system， tumor angiogenesis， tumor cell proliferation， apoptosis， migration， etc. These targets were mainly enriched in thyroid hormone signaling pathway， estrogen signaling pathway， PI3K/AKT signaling pathway， etc. MTT results showed that compared with the control group， the proliferation of CNE2 cells was significantly inhibited in Fuling （Poria） groups （2.5， 5.0， 10 μmol·L-1） （P<0.05 or P<0.01）. Western blot results showed that compared with control group， Fuling （Poria） group （5.0 μmol·L-1） decreased the expression levels of PI3K and p-AKT， the key proteins of PI3K/AKT signaling pathway in CNE2 cells after treated for 24 hours （P<0.05 or P<0.01）， but there was no significant difference in the expression of AKT（P>0.05）. Conclusion Fuling （Poria） can affect the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells through multiple components， multiple targets and multiple pathways. It was confirmed that the inhibitory effect of Fuling （Poria） on nasopharyngeal carcinoma cells proliferation was related to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

〔Keywords〕 network pharmacology; Fuling （Poria）; nasopharyngeal carcinoma; molecular mechanism

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其惡性程度高，70%的患者被確診時已為晚期[1-2]。以放療和化療相結合的綜合治療是目前治療NPC的主要方法，但復發和遠處轉移仍是治療失敗的主要原因[3]。目前，中醫藥抗腫瘤藥物日益受到關注，因其與化療藥物相比，在抑殺腫瘤細胞的同時，具有毒副作用小、不易產生耐藥性等特點[4]。

中藥茯苓Poria cocos （Schw.） Wolf.屬多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核[5]，其主要分布在我國安徽、福建、河南、四川、云南、貴州、湖北和廣東、廣西等地[6]。茯苓載于《神農本草經》，其性味甘、淡、平，歸心、肺、脾、腎經，具有健脾寧心、利水滲濕等功效。現代藥理學研究[7]發現，茯苓的主要化學成分為三萜類和多糖類，具有抗炎、抗腫瘤、利尿、調節免疫功能等多種藥理作用。課題組前期研究發現茯苓酸能抑制鼻咽癌細胞增殖，并能降低增殖相關蛋白生存素、X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白、增殖細胞核抗原的表達水平[8]，但茯苓抗NPC的物質基礎及分子機制尚不清楚。

因此，本研究基于網絡藥理學，構建了茯苓的活性成分、NPC與藥物靶點之間的相互作用網絡，并進行實驗驗證，為揭示茯苓抗NPC的物質基礎和潛在分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1? 茯苓活性成分的篩選

應用TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及BATMAN-TCM數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索茯苓的所有活性成分。根據研究結果，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為限制條件進行篩選，得到茯苓的生物活性成分。

1.2? 活性成分-靶點互作網絡構建

應用TCMSP數據庫及BATMAN-TCM數據庫平臺檢索茯苓所有活性成分的靶基因，并應用Perl語言程序結合UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org）對茯苓活性成分的靶點進行標準化，獲得標準化的靶點。通過Cytoscape 3.7.1軟件（https：//cytoscape.org/）構建活性成分-靶點互作網絡，以探究茯苓的藥理學作用機制。

1.3? 鼻咽癌的疾病靶點篩選

以“nasopharynx cancer”為檢索關鍵詞，通過GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）及OMIM 數據庫（https：//www.omim.org/）檢索NPC的疾病靶點，并將兩個數據庫檢索出來的疾病靶點進行合并。

1.4? 活性成分與疾病的共同靶點篩選及PPI網絡構建

篩選NPC的疾病靶點與茯苓活性成分的靶點之間的共同靶點，應用R軟件（https：//www.r-project.org/）編程進行篩選，并繪制韋恩圖。應用STRING（https：//string-db.org/）插件構建共同靶點互作網絡（protein-protein interaction， PPI），參數保持默認設置，獲得PPI網絡。

1.5? 活性成分-鼻咽癌-靶點互作網絡構建

應用Cytoscape 3.7.1軟件構建活性成分-NPC-靶點互作網絡，查閱文獻，基于構建的網絡探討茯苓對鼻咽癌療效的潛在分子機制。

1.6? Gene Ontology（GO）生物功能分析和KEGG Pathway富集

應用R軟件（https：//www.r-project.org/）編程獲得NPC與茯苓活性成分的共同靶點的entrez ID，接著對共同靶點進行GO分析和KEGG Pathway富集分析，GO分析主要用于描述基因產物的功能，KEGG Pathway富集分析主要用于分析核心通路富集程度，進一步探索茯苓抗NPC可能的生物功能及信號通路機制。

1.7? 細胞實驗驗證

人鼻咽癌CNE2細胞購自北京北納創聯生物技術研究院，由本實驗室傳代培養。茯苓酸購自上海金穗生物科技有限公司;順鉑（Cisplatin），齊魯制藥有限公司（貨號：H20023460）。采用不同濃度（0、2.5、5.0、10、20 μmol·L-1）的茯苓酸、陽性對照藥順鉑（Cisplatin，4 mg·L-1）處理鼻咽癌細胞24、48、36 h，使用MTT法檢測處理后細胞的增殖情況。用不同濃度（0、2.5、5.0 μmol·L-1）的茯苓酸干預細胞24 h，采用Western blot法檢測茯苓酸對鼻咽癌細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達水平。具體方法參考文獻[9-10]進行。

1.8? 統計學分析

采用SPSS 26.0統計軟件處理，計量資料實驗數據服從正態分布，數據以“x±s”表示。單因素設計和多組間計量資料比較采用單因素方差分析，多重比較則采用LSD法，P<0.05認為差異有統計學意義。結果分析圖由GraphPad Prism 8.0軟件制作完成。 2 結果

2.1? 茯苓活性成分篩選

通過TCMSP、BATMAN-TCM數據庫對茯苓的活性成分進行檢索，并以OB≥30%和DL≥0.18為限制條件進行篩選，去掉重復成分后共得到17個生物活性成分。結果見表1。

2.2? 活性成分-靶點互作網絡構建

通過上述數據庫篩選，由Cytoscape 3.7.1軟件可獲得與茯苓相關的活性成分的作用靶點共70個（不含重復），構建活性成分-靶點互作網絡。其中排名前3的是：MOL000291（poricoic acid B，茯苓新酸B），其degree為29;MOL000289（pachymic acid，茯苓酸），其degree為23;MOL000296（hederagenin，常春藤皂甙元），其degree為16。見圖1。

2.3? 鼻咽癌的疾病靶點篩選

通過檢索GeneCards、OMIM數據庫得到NPC的疾病治療靶點，不設置Relevance score，并刪去重復靶點，共得到1 968個NPC的疾病治療靶點。

2.4? 共同靶點篩選及互作網絡構建

將1 968個NPC的疾病治療靶點與70個藥物活性成分作用靶點應用R軟件編程篩選出共同靶點并畫出韋恩圖，得到共同靶點為18個，得到的韋恩圖見圖2;應用STRING數據平臺輸入18個共同靶點，默認設置下構建互作網絡（PPI），見圖3。應用R軟件編程統計各靶點出現頻次，出現頻次較高的有TP53、INS、ESR1、PTGS2等，可作為茯苓治療NPC的潛在靶點，見圖4。

2.5? 活性成分-鼻咽癌-靶點互作網絡構建

采用Cytoscape 3.7.1軟件在活性成分-NPC-靶點互作網絡圖中，共獲得28個節點（靶點18個，活性成分8個，疾病和藥物各1個），見圖5。在圖中我們可以看出排名前3的活性成分為pachymic acid（茯苓酸）、hederagenin（常春藤皂甙元）、poricoic acid B（茯苓新酸B） 。

2.6? 茯苓治療鼻咽癌的生物功能（GO）分析及核心通路篩選

并利用R軟件編程對以上共同靶點進行GO功能分析得到的柱狀圖見圖6，其靶點主要涉及細胞因子活性、免疫炎癥系統和腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等生物過程。這體現了茯苓可能通過調控多個生物過程來治療NPC。圖7顯示了茯苓作用靶點的KEGG Pathway富集分析結果，表2中列出了富集靶點數目≥4的信號通路，這表示茯苓主要通過作用于4條信號通路來治療NPC。

2.7? 實驗結果

2.7.1? MTT檢測茯苓酸對CNE2細胞增殖的影響

MTT結果顯示，與對照組比較，不同濃度茯苓酸組（2.5、5.0、10 μmol·L-1）和順鉑4 mg·L-1組分別作用 CNE2細胞24、36、48 h后，對CNE2細胞增殖具有明顯抑制作用，差異均具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。見圖8。

2.7.2? Western blot法檢測茯苓酸對鼻咽癌細胞PI3K/AKT信號通路的影響? 藥物處理24 h后，與對照組比，茯苓酸5.0 mol·mL-1組降低了PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白PI3K、p-AKT的表達水平（P<0.05或P<0.01），對AKT的表達無明顯差異性（P>0.05）。見圖9。

3 討論

NPC是一種上皮源性惡性腫瘤，是我國南方各省常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前其主要治療方法為放化療[11]。茯苓以三萜類和多糖類為主要化學成分，現代藥理學研究發現[7]，其具有抗炎、抗腫瘤和調節免疫功能等多種藥理作用。

網絡藥理學通過蛋白質組學、基因組學、生物信息學等數據庫檢索，從分子和整體水平進行中藥的系統分析，獲得中藥的核心化學成分-蛋白靶標，明確中藥的作用機制，為中藥研究提供新的思路[12]。本研究基于網絡藥理學，通過數據庫篩選，共獲得茯苓17個生物活性成分，通過構建活性成分-靶點互作網絡，得到與茯苓相關的活性成分的作用靶點共70個，并獲得茯苓酸、茯苓新酸B和常春藤皂甙元等關鍵活性成分。近年來研究發現：茯苓酸可通過抑制線粒體途徑來誘導胃癌細胞凋亡[13]，且茯苓酸也可誘導人膀胱癌細胞T24凋亡[14]。

對茯苓與鼻咽癌的共同靶點進行PPI映射，并構建茯苓活性成分-NPC-靶點網絡，發現出現頻次較高的靶點有TP53、INS、ESR1、PTGS2等，這些靶點主要涉及細胞因子活性、免疫炎癥系統、腫瘤新生血管形成和腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等，這些生物過程在鼻咽癌的發生發展中均具有重要作用。文獻報道，鼻咽癌組織內存在TP53基因突變[15-16]，其可通過調控Bcl-2和Bax的表達，阻滯細胞周期，誘導細胞衰老或凋亡[17]。PTGS2即為環氧合酶COX-2的別稱，研究發現沉默COX-2的表達，可阻滯細胞周期，抑制鼻咽癌細胞的增殖能力[18]。KEGG通路富集分析顯示靶點主要富集在甲狀腺激素信號通路、雌激素信號通路、PI3K/AKT等信號通路。研究證實，PI3K/AKT信號通路在鼻咽癌、胃癌和肝癌等多種癌癥發揮關鍵作用，該通路參與血管生成和細胞增殖、分化、遷移、凋亡等調節[19]。

最后，本研究團隊的實驗結果表明，茯苓酸能明顯抑制鼻咽癌CNE2細胞增殖（P<0.05或P<0.01），且明顯降低了PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白PI3K、p-AKT的表達水平（P<0.05或P<0.01），提示茯苓酸可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路實現抑制鼻咽癌細胞增殖的效應。綜上所述，本研究系統預測了茯苓抗NPC的作用機制，證實茯苓酸是茯苓抗NPC的物質基礎之一，PI3K/AKT信號通路是其發揮抗NPC作用的重要機制之一，為茯苓臨床干預NPC提供了一定的理論依據。

參考文獻

[1] 何文龍，呂? 炎，胡云揚，等.放射聯合藥物治療鼻咽癌的現狀[J].實用癌癥雜志，2019，34（2）：346-348.

[2] PETERSSON F. Nasopharyngeal carcinoma： A review[J]. Seminars in Diagnostic Pathology， 2015， 32（1）： 54-73.

[3] 邱元正，劉? 超，李? 果.鼻咽癌放射治療的現狀與對策[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2015，21（6）：435-438.

[4] 黃自麗，黃修燕，鄭? 起.中藥抗腫瘤作用及其作用機制研究進展[J].醫學綜述，2010，16（3）：386-389.

[5] 張? 敏，高曉紅，孫曉萌，等.茯苓的藥理作用及研究進展[J].北華大學學報（自然科學版），2008，9（1）：63-68.

[6] 中國藥科大學.中藥辭海[M].北京：中國醫藥科技出版社，1996：1272-1278.

[7] 金? 惠，趙英博，江? 維，等.茯苓藥理作用及臨床應用研究進展[J]. 湖北中醫雜志，2008，30（4）：59-61.

[8] 劉? 潔，胡? 晶，戴? 娜，等.益氣解毒方主要三萜類化合物抑制鼻咽癌 CNE2 細胞增殖效應的比較[J].湖南中醫藥大學學報，2019，39（11）：1315-1320.

[9] ZHOU F L， HU J， DAI N， et al. Berberine and ginsenoside Rg3 act synergistically via the MAPK/ERK pathway in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Journal of Functional Foods， 2020， 66： 103802.

[10] 熊? 雨，劉? 潔，鄒? 攀，等.益氣解毒方中苯丙素類化合物對鼻咽癌細胞增殖效應的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2021，41（5）：701-706.

[11] 鄒? 攀，劉? 潔，許紅淼，等.基于網絡藥理學探討黃連和黃芪治療鼻咽癌的作用機制[J].中國新藥與臨床雜志，2021，40（4）：276-281.

[12] 劉鑫馗，吳嘉瑞，張? 丹，等.基于網絡藥理學的參附湯作用機制分析[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（16）：211-218.

[13] LU C W， MA J， CAI D F. Pachymic acid inhibits the tumorigenicity of gastric cancer cells by the mitochondrial pathway[J]. Anti-Cancer Drugs， 2017， 28（2）： 170-179.

[14] JEONG J W， BAEK J Y， KIM K D， et al. Induction of apoptosis by pachymic acid in T24 human bladder cancer cells[J]. Journal of Life Science， 2015， 25（1）： 93-100.

[15] LI H， HAN W N， ZHANG L， et al. Possible reasons for TP53 accumulation in nasopharyngeal carcinoma using atlas human cancer cDNA expression array[J]. Chinese Journal of Cancer Research， 2002， 14（1）： 28-32.

[16] 謝? 奕，姚開泰，胡維新.鼻咽癌、宮頸癌和肺癌中p53基因突變和表達的對比研究[J].中華病理學雜志，1997，26（4）：38-41.

[17] BYKOV V J N， ERIKSSON S E， BIANCHI J L， et al. Targeting mutant p53 for efficient cancer therapy[J]. Nature Reviews Cancer， 2018， 18（2）： 89-102.

[18] 李? 剛，李湘平，陳順金，等.RNA干擾沉默COX-2對鼻咽癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響[J].廣東醫學，2009，30（1）：45-48.

[19] 成南南，楊萌哲，楊建宇，等.基于網絡藥理學探討野菊花治療鼻咽癌的可能作用機制[J/OL].基因組學與應用生物學：1-15[2021-09-16].

http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1369.q.20201207.1400.002.html.