高效液相色譜柱后衍生法測定大黃?蟲丸中的黃曲霉毒素

賀敏才，盧向紅，袁邦群

(婁底市食品藥品檢驗檢測所，湖南婁底 417000)

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉中產毒菌株產生的一類致癌物質，可誘發肝、腎、肺、胃、結腸等部位的癌變，是目前為止發現的毒性最大的真菌毒素。黃曲霉毒素可以通過多種途徑污染食品和飼料，直接或間接地進入食物鏈，從而威脅人們的健康和生命安全。目前有100多個國家已經制訂了食品中黃曲霉的法規標準及檢測方法，我國也已于2011年4月20日發布了《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2011），其規定了食品中黃曲霉毒素的限量指標。《中國藥典》2005年版增補本收載了黃曲霉毒素的測定方法，并規定了部分品種的限量值[1]。

大黃?蟲丸是由熟大黃、土鱉蟲、水蛭、虻蟲、桃仁、炒苦杏仁、黃芩、地黃、白芍、甘草等十二味藥經粉碎、過篩和混勻制成的復方制劑。其功效是活血破瘀，通經消癥。常用于瘀血內停所致的癥瘕、閉經，癥見腹部腫塊、肌膚甲錯、面色黯黑、潮熱羸瘦、經閉不行[2]。《中國藥典》2020年版一部對其中的土鱉蟲、水蛭、桃仁的黃曲霉毒素進行了限量控制[2]。目前對大黃?蟲丸安全性方面的研究尚未見報道，為進一步保證藥品的安全性，本試驗參照《中國藥典》2020年版四部通則2351及有關文獻資料[3-9],采用高效液相色譜法柱后衍生法，對大黃?蟲丸中黃曲霉毒素進行檢測，以了解大黃?蟲丸中黃曲霉毒素污染狀況，并為臨床安全用藥提供數據資料。

1 儀器與方法

1.1 儀器

Waters e2695高效液相譜儀（帶自動進樣器、柱溫箱、2475熒光檢測器、Empower3工作站）；梅特勒-托利多XS303S電子分析天平（千分之一）；光化學衍生器Huirentek PHRED-HR；高速勻質機D-500（Made by Wiggens）；離心機TG16G（湖南凱達科學儀器有限公司）。

1.2 試劑

免疫親和柱（ROMER，AflaStarTM R，Lot：1000004945）；黃曲霉毒素混合標準品溶液（中國食品藥品檢定研究院610001-201602）；甲醇、乙腈均為色譜純；Ⅰ級純化水（自制）；其他試劑均為分析純。大黃?蟲丸（批號為20170908、20171112、20171217、20180503、20180810、20181109、20190505、20191202、20191211、20200610，由某制藥公司生產）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Intersil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相為甲醇-水，梯度洗脫（比例見表1），流速為1.0 mL/min；柱后衍生-光化學衍生法；熒光檢測器，激發波長360 nm，發射波長450 nm，進樣量20 μL。

表1 HPLC梯度洗脫表

1.3.2 溶液制備

（1）混合對照品溶液制備。取黃曲霉毒素混合標準品溶液（黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2標示濃度分別為1.02 μg/mL、0.43 μg/mL、1.06 μg/mL、0.38 μg/mL）1.00 mL，加甲醇稀釋至50.00 mL，作為儲備液，量取儲備液1.00 mL，加甲醇稀釋至10.00 mL。

（2）供試品溶液制備。取供試品粉末15 g，置均質瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min（攪拌速度大于11 000 r/min），離心5 min（離心速度4 000 r/min），精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，離心5 min（離心速度4 000 r/min），取上清液20.00 mL，通過免疫親和柱，流速3 mL/min，用20 mL水洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再加2.00 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用甲醇稀釋至2.00 mL，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取濾液備用。

（3）陰性樣品溶液制備。取檢測無黃曲霉毒素的藥材，按照藥典制法制成大黃?蟲丸樣品，取樣品15 g，同供試品方法制備，即得。

2 結果與分析

2.1 系統適應性試驗

按照1.3.1的色譜條件，分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖（見圖1）。由圖1可知，黃曲霉毒素各組分完全分離（分離度大于1.5），陰性樣品無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性相關性考察

按照1.3.1的色譜條件，精密吸取1.3.2（1）的黃曲霉毒素混合對照品溶液 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL 和 25 μL 進行測定，記錄色譜圖，以對照品量為橫坐標（X,pg），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結果見表2

表2 回歸方程及線性范圍

2.2.2 精密度試驗

按照1.3.1的色譜條件，吸取混合對照品溶液15 μL，進樣6次，測定峰面積，結果表明，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分別為2.43%，1.86%，2.99%，2.05%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗

取供試品溶液（批號20191202）1.0mL，加入混合對照品溶液0.10 mL，分別制備2 h、4 h、6 h、12 h、16 h和24 h后，按照1.3.1的色譜條件進行測定，結果表明，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分別為2.03%，1.98%，2.69%，2.32%，表明供試品溶液在24 h內測定穩定。

2.2.4 重復性試驗

取樣品（批號20180810），按1.3.2（2）的方法，制備6份供試品溶液，按照1.3.1的色譜條件進行測定。結果表明，黃曲霉素B1的RSD為3.02%，黃曲霉毒素總量的RSD為4.12%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗

精密稱取未檢出黃曲霉毒素的樣品約7.5 g（批號20181109），6份，分別加入1.3.2（1）的黃曲霉毒素混合對照品溶液儲備液0.10 mL，按照1.3.2（2）的方法制備，按照1.3.1的色譜條件進行測定，計算黃曲霉毒素的RSD和回收率。結果表明，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分別為94%，86%，89%，83%；RSD分別為1.89%,1.56%，2.11%，2.03%（n=6）。

2.2.6 檢測限和定量限試驗

倍比稀釋混合對照品溶液，在信噪比約為3時，測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測限分別為0.408 pg，0.172 pg，0.424 pg，0.152 pg；在信噪比約為10時，測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量限分別為1.346 pg，0.585 pg，1.421 pg，0.519 pg。

2.2.7 樣品含量測定

取10批次樣品，按照1.3.2（2）的方法制備供試品溶液，按照1.3.1的色譜條件進行測定，結果見表3。

表3 樣品測定結果（n=2）

3 結論

①本試驗中，曾按《中國藥典》一部方法選用甲醇-乙腈-水（40∶1842）作為流動相，分離效果不理性，樣品中其他成分干擾大，最后選用甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，各黃曲霉毒素峰分離效果好，其他成分無干擾。②對10批次樣品進行檢測，其中有9批中有黃曲霉毒素的檢出，結果黃曲霉毒素B1的含量均少于1 μg/kg，黃曲霉毒素的總量均小于2 μg/kg，都低于藥典規定的限度值（5 μg/kg，10 μg/kg）。表明大黃?蟲丸安全性較好，但檢出率高到90%，仍應重視黃曲霉毒素的檢測。③本方法具有專屬性強，操作簡單，結果穩定可靠，分離度好等特點，可作為用于大黃?蟲丸中黃曲霉毒素的含量測定的方法。④大黃?蟲丸中的熟大黃、桃仁、炒苦杏仁、甘草等及主要輔料蜂蜜，有的屬于藥食同源，有的可用于保健食品。而本次試驗中黃曲霉毒素的檢出率極高，相關部門應反思其原料的安全性，尤其上述廣泛作為食品使用的藥材，進而保證廣大消費者的飲食用藥安全。