小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量測定的不確定度評定

袁 夢，胡 莎，葛文靜

（青島市糧油質量檢測和軍隊糧油供應中心，山東青島 266042）

真菌毒素廣泛的存在于食品和飼料中，全球都普遍面臨著真菌毒素污染的重大問題，嚴重威脅著人類和動物的生命安全[1-2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一種是單端孢霉烯族毒素，具有較強的熱抵抗力和耐酸性[3]，食用了DON污染的食物后，可對人和動物的腸道、大腦及神經系統產生毒害作用，使動物產生厭食和嘔吐反應等急性中毒癥狀[4]，嚴重時損害造血系統造成死亡[5-7]，因此DON又稱嘔吐毒素[8-11]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數。測量不確定度通常包括很多分量[12]。其中一些分量是具有統計性的，另一些分量是具有非統計性的。為得到準確、可靠和科學的實驗數據，不確定度的評定具有重要作用。DON含量的定量分析結果應包括測量值和測量不確定度，能更準確地反映脫氧雪腐鐮刀烯醇的濃度。本次實驗采用《糧油檢驗 主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯質譜法》（LS/T 6133—2018）[13]測定小麥中DON的含量，參照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[14]，建立DON不確定度的評定方法，分析在檢測過程中產生的不確定度分量[15-16]，對各分量進行計算得到合成標準不確定度、擴展不確定度，以及各分量的相對貢獻，能夠為更準確、科學的評定檢測結果提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290-6460 超高液相色譜-串聯質譜儀（美國Agilent公司）；DT300A百分之一分析天平（江蘇省意歐儀器儀表有限公司）；3-18ks離心機（德國Sigma公司）；C18色譜柱（Agilent公司，100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

DON標準液濃度（濃度為100.6 μg/mL，不確定度為1.2 μg/mL，Pribolab公司）；13C15-脫氧雪腐鐮刀烯醇同位素內標（13C15-Deoxynivalenol，13C15-DON，濃度為25 μg/mL，不確定度為0.2 μg/mL，Pribolab公司）；乙腈、甲醇、乙酸銨、乙酸（分析純，美國Merck公司）。

樣品提取液：乙腈-水-乙酸混合液（70∶29∶1，V∶V∶V，自行配制）。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜-串聯質譜儀色譜條件儀器條件柱溫35 ℃；進樣量：1 μL；流速：0.20 mL/min；流動相：A為1%乙酸溶液和5 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為甲醇；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.2.2 高效液相色譜-串聯質譜儀質譜條件

電離模式：電噴霧電離源（ESI）負離子模式；毛細管電壓：4 kV（+），3.5 kV（-）；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑流量：10 L/min；碰撞氣體：氬氣；掃描模式（scan type）：多反應監測模式（MRM）；駐留時間：30 ms，質譜條件參數見表2。

表2 目標化合物的質譜條件

1.2.3 標準溶液配制

配制標準溶液的稀釋液為乙腈-水-乙酸（35∶64.5∶0.5，V∶V∶V）混合液。

100.6 μg/mL的DON標準液配制得到10 μg/mL的DON標準儲備液，然后經過稀釋得到1.5 μg/mL的DON標準工作液，稀釋1.5 μg/mL的DON標準液得到一系列濃度標準工作液，濃度分別為 37.5 μg/mL、75 μg/mL、150 μg/mL、375 μg/mL和1 500 μg/mL的標準溶液。準確吸取0.8 mL的13C15-DON內標液于10 mL容量瓶中，定容至刻度線，得到2 μg/mL的13C15-DON同位素內標標準工作液。

1.2.4 樣品前處理

粉碎小麥樣品，過500 μm孔徑試驗篩，混勻。準確稱取5 g（精確到0.01 g）小麥樣品于50 mL離心管，加入20 mL提取液，渦旋或振蕩提取30 min，然后用離心機6 000 r/min離心10 min，吸取0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL超純水，旋渦混勻，在4 ℃以下12 000 r/min離心10 min，上清液過0.2 μm的聚四氟乙烯濾膜，收集濾液A。

1.2.5 添加13C15-DON同位素內標液

準確吸取180 μL濾液A或者標準系列工作曲線于進樣小瓶中，加入20 μL之前配制好的13C15-DON同位素內標工作液，旋渦混勻，上機待測。

1.2.6 樣品檢測與計算

按照上述方法以及儀器條件測定樣品，經過液相色譜-串聯質譜聯用儀上機檢測，以DON系列標準工作液各點濃度與13C15-DON內標液濃度之比為橫坐標（x軸），以DON系列標準工作液各濃度的峰面積與13C15-DON內標液的峰面積之比為縱坐標（y軸），以各個數值點做最小二乘線性擬合做工作曲線（1）：

按式（2）計算待測樣品中DON濃度：

式中：X-待測樣品中DON含量，單位為μg/kg；x-待測樣品溶液中待測毒素與內標的濃度比；r-待測毒素對應的內標濃度，單位為μg/kg；V-加入提取液的體積，20 mL；f-提取液稀釋因子，為2；m-待測樣品稱量質量，單位為g。

2 結果與分析

2.1 測量不確定度的來源分析

根據CNAS-GL006-2019化學分析中不確定度的評估指南，上述數學模型和檢測方法操作步驟，測定小麥中DON的不確定度來源于以下幾個方面：待測樣品檢測重復性引入的不確定度；標準曲線系列工作液配制過程引入的不確定度；標準曲線系列工作液擬合產生的不確定度；樣品制備前處理過程中引入的不確定度；內標引入的不確定度；檢測方法及儀器設備引入的不確定度。

2.2 各不確定度分量的分析和評定

2.2.1 重復檢測引入的不確定度評定

重復檢測引入的不確定度屬于A類不確定度。實驗室日常檢測，無法將所有的樣品進行前處理，這就會引起檢測結果的不準確，因此只能通過混勻粉碎混勻，盡量確保樣品的均勻性，增加檢驗次數，盡量減少樣品的不均勻性引起的實驗誤差。為了評定重復性檢測的不確定度分量，分別稱取6份小麥樣品，經過前處理上機檢測計算得到質控樣品的濃度，結果見表3。

表3 DON樣品重復測定數據

6個試樣測定結果平均值=1 930 μg/kg，單次測定的標準偏差為：

n=6，重復性檢測引入的標準不確定度為：

因此，重復測定帶來的平均值相對不確定度為：

2.2.2 標準溶液引入的不確定度評定

標準溶液引入的不確定度來源主要包括標準品純度引入的相對標準不確定度、配置系列標準曲線工作液時產生的相對標準不確定度、不同濃度的標準曲線線性擬合產生的相對標準不確定度。

（1）標準溶液純度引入的不確定度評定。經查本次實驗使用的DON標準液標品證書，DON標準液濃度 為 100.6 μg/mL， 其 擴 展 不 確 定 度 為 1.2 μg/mL（ 包 含因子k=2），則標準溶液的相對不確定度為 （ub-1）=

（2）配制系列標準曲線工作液時產生的不確定度評定。用1.00 mL移液管移取1.00 mL的100.6 μg/mL的DON標準液于10 mL容量瓶，定容至刻度線，得到10 μg/mL的DON標準儲備液。用有1 mL移液槍分兩次移取1.5 mL的DON標準儲備液于10 mL容量瓶，定容至刻度線，得到1.5 μg/mL的DON標準工作液，分別移取2.5 mL、1 mL、0.5 mL、0.25 mL的1.5 μg/mL DON標準工作液標準液到10 mL容量瓶中，分別得到 37.5 μg/L、75 μg/L、150 μg/L、375 μg/L和1 500 μg/L的標準液。經查10 mL容量瓶20 ℃時最大允誤u=0.020 mL，1 mL移液管20 ℃時最大允差為u=0.008 mL，1 mL移液槍20 ℃時相對最大允許誤差為u=1%，配制過程不同移液器相對不確定度見表4。

表4 使用不同量程移液器的相對不確定度表

配制好工作液標準曲線，用200 μL的移液槍取180 μL的標準液和 20 μL 內標標準液，200 μL 的 20 ℃ 時最大允 誤 （u200 μL）=1.5%，（u20 μL）=4.0%，重 復操作5次，配制一個含內標標準液的相對標準不確定度

因此，配置不同濃度的標準曲線工作液帶入的不確定度為：

標準溶液引入的不確定度為：

（3）不同濃度的標準曲線線性擬合產生的不確定度評定。按照方法對不同濃度的DON系列標準液共檢測5次，根據表5，測得的數據進行線性擬合得到線性方程y=1.034 24x+0.036 26，相關系數R=0.999 97，參與標準曲線的點n=5，標準曲線的重心（2.137 5，2.246 9），即

表5 內標法標準曲線測量值與理論值對應關系表

殘余標準偏差為：

待測樣品上機檢測6次，由標準曲線計算得到待測樣品平均DON濃度為，則通過標準曲線擬合引入的標準不確定度為：

SR為殘余標準偏差，b為標準曲線方程斜率，p為標準溶液的測定總次數，n為待測樣品液測定次數，為待測樣品液與內標濃度之比的平均值； 為標準曲線各點濃度濃度與內標濃度之比平均值；ci為標準曲線上各點濃度與內標濃度之比；計算得到u=0.012 05，因此相對不確定度為

2.2.3 樣品制備過程中引入的不確定度評定

（1）待測樣品稱量過程引入的不確定度。本實驗采用百分之一天平稱取樣品5 g，經查天平的計量檢定證書得到最大允差為0.5e，其中e=0.1 g，因此最大允差為0.05 g，標準不確定度相對不確定度

（2）待測樣品前處理過程中移液槍引入的不確定度評定。待測樣品前處理過程中使用5 mL移液槍4次，5 mL移液槍20 ℃時最大允許誤差為u=0.6%，相對不確定度使用1 mL移液槍2次，1 mL移液槍20 ℃時相對最大允許誤差為相對不確定度（矩

待測樣品稱量制備前處理過程產生的相對不確定度：

2.2.413C15-DON同位素內標引入的不確定度評定

經查13C15-DON同位素內標標準品證書得到擴展不確定度u=0.2 μg/mL，k=2，同位素內標的標準不確定度（u內）同位素內標的相對不確定度

配制2 μg/mL內標標準液，1 mL移液槍取0.8 mL內標液與10 mL容量瓶，此過程相對不確定度

13C15-DON同位素內標引入的相對不確定度（u5）=

2.2.5 高效液相色譜-質譜聯用儀引入的不確定度評定

經查高效液相色譜-質譜聯用儀儀器計量鑒定認證證書，儀器的擴展不確定度是u=11%，k=2，因此此儀器的相對不確定度

2.3 內標法測定小麥中DON含量的合成不確定度

高效液相色譜-質譜聯用儀內標法測定小麥中DON的不確定度分量包括重復檢測引入的不確定度、標準溶液引入的不確定度、樣品制備過程中引入的不確定度、DON同位素內標引入的不確定度、高效液相色譜-質譜聯用儀引入的不確定度。合成DON含量的相對標準不確定度：

各不確定度分量對合成相對標準不確定的相對貢獻大小見表6。

表6 不確定度分量的相對貢獻

由表4可知，儀器引入的不確定度相對貢獻最大，其次是配制標曲、樣品前處理過程、重復性檢測、同位素內標引入的不確定度，標準曲線線性擬合引入的不確定度最小。

取置信水平為95%，k=2，因此擴展不確定度為U=k×u×c=2×0.066 40×1 930=256 ug/kg。高效液相 - 質譜聯用儀內標法測定小麥中DON的含量結果為（1 930±256）μg/kg（k=2）。

3 結論

高效液相色譜-質譜聯用儀內標法測定小麥中DON含量的不確定度評定最終結果表示為（1 930±256）μg/kg（k=2），擴展不確定度為256 μg/kg。本次測定過程的不確定度分量中，高效液相色譜-質譜聯用儀引入的不確定度分量為0.055 00，對合成不確定度的影響最大，其次是配制標曲、樣品前處理過程、重復性檢測、同位素內標引入，而標準曲線線性擬合引入的不確定度分量為對結果的影響最小。