堿性蛋白酶法制備鮮牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工藝研究

賈永紅，廉立偉，劉小濤，周潤芝

（1.浙江萬里學院，浙江寧波 315100；2.寧波市牛奶集團有限公司，浙江寧波 315033）

高血壓是一種嚴重危害人類健康的心血管疾病，以血壓長時間、持續性升高為典型特征。伴隨日常膳食中油脂類、固醇類成分增多，生活節奏加快和壓力加大以及生態環境的污染破環，近年來我國高血壓患者數量持續增多，已給患者家庭和社會帶來沉重的經濟和護理負擔[1]。據統計，我國高血壓患者約3億，其死亡率約占總死亡人數的42.5%[1-3]。長期以來，高血壓病臨床治療藥物的作用機制主要包括β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉換酶抑制劑（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor，ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑、鈣拮抗劑及α受體阻滯劑等，雖然降壓機制多樣，但長期服用會產生耐藥性及一些副作用[4-6]。因此，當前以非藥物形式如食療法來治療高血壓的探討日益增加[5]，特別是一些藥食同源的動植物越來越受高血壓患者的青睞[7]。

牛奶是一種營養價值豐富、方便易得的日常飲品，其中富含酪蛋白。自從1979年BRANTLE V等[8]從牛乳酪蛋白酶解產物中獲得一個由7個氨基酸組成的短肽以來，牛奶粗蛋白，特別是酪蛋白已經成為生物活性肽制備的主要原料之一。ACEI作為一種對高血壓治療有顯著效果的活性多肽，多年來是研究者關注的重點。例如MARUYAMA[9]從酪蛋白水解物中獲得一個ACEI，NAKAMURA[10]從酸奶中獲得兩個具有ACEI活性的三肽。

鑒于不同來源的鮮牛奶中蛋白質種類和成分的差異，本項目以寧波本地公司生產的鮮牛奶為原料開展堿性蛋白酶水解牛奶粗蛋白制備ACEI混合肽的研究，并通過正交實驗優化多個酶解因素，確定了一條具有較高ACEI混合肽得率的酶解工藝。本項目的研究可為當地乳品企業開展鮮奶精深加工提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鮮牛奶（市售鮮奶），寧波本地奶業公司；堿性蛋白酶（索萊寶，1∶200 000），北京；甘氨酰甘氨酰酪氨酰精氨酸四肽標準品（Gly-Gly-Tyr-Arg）（Peptides International），美國；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）（Merck），美國；ACE（Merck），美國；亮氨酸（Leu）（Amresco），美國；三氯乙酸、雙縮脲試劑、甲醛、硼酸、鹽酸、β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸鹽等，均為國產分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮奶粗蛋白的提取及蛋白含量檢測

參考呂桂善等[11]的方法并稍做修改，取1 kg鮮牛奶于大燒杯中，將其置于磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱至80 ℃左右，約30 min，然后4 000 r/min離心20 min，將其脫脂。用6 mol/L的鹽酸調脫脂鮮奶溶液pH到4.6，使蛋白沉淀。接著，4 000 r/min離心15 min去除上清液。再用蒸餾水洗滌粗蛋白沉淀，調節其pH為中性，再次離心去除上清液，將沉淀冷凍干燥，即為鮮牛奶粗蛋白。粗蛋白中蛋白質含量的檢測采用凱氏定氮法。

1.2.2 粗蛋白堿性蛋白酶水解物的制備與多肽水解率測定

參考白騰輝等方法并修改[12]。在50 mL蒸餾水中加入一定量的鮮牛奶粗蛋白（15 mg/mL），磁力攪拌器上充分攪拌使其溶解，根據堿性蛋白酶標示的pH值調節水解酸堿度，然后加入一定量的堿性蛋白酶，在一定溫度下的恒溫振蕩器內水解，持續一段時間后，100 ℃水浴10 min滅酶活以停止酶解反應，將酶解混合液冷卻至室溫備用。

參考魯偉等[13]的多肽濃度檢測法測定酶解物的肽水解率。取2.5 mL粗蛋白堿性蛋白酶水解物，加入2.5 mL10%（W/V）的三氯乙酸（TCA）水溶液，漩渦混合儀混合均勻后靜置10 min，然后以4 000 r/min離心15 min，將上清液全部轉移到50 mL的容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，搖勻。之后，取6.0 mL上述溶液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0 mL（樣液∶雙縮脲試劑=3∶2，V/V），于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測定OD值，對照標準曲線求得樣品溶液中多肽濃度C（mg/mL），進而求得樣品中多肽含量。以不同濃度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準溶液為橫坐標X（mg/mL），以在OD540為縱坐標Y，繪制標準曲線。

1.2.3 粗蛋白堿性蛋白酶水解工藝的正交實驗

依據已有的研究報道，本實驗設置L25（54）的正交實驗表，4因素5水平參數設計如下：溫度參數為37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃；pH值參數為 8、9、10、11、12；酶和底物組成比例參數為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60；水解時間為60 min、120 min、180 min、240 min、300 min。依據Design Expert軟件設計水解組合方案，測定每個組合的多肽水解度。

1.2.4 堿性蛋白酶水解物的ACEI體外活性測定

根據CUSHMAN的方法[14]采用以HHL為底物的非連續分光光度法并稍加改動。將250 μL HHL加入100 μL超純水或不同酶解條件組合方案所獲得的肽混合物后，37 ℃水浴預熱5 min，立即加入150 μL ACE保溫反應90 min后立即加入250 μL 0.5 mol/L HCl終止反應。空白對照組在加入ACE之前加入250 μL 0.5 mol/L HCl后75 ℃水浴5 min，加入ACE，再保溫5 min。反應后加入3 mL乙酸乙酯萃取5 min，靜置5 min后移取乙酸乙酯層2 mL至干凈試管中，85 ℃水浴蒸除乙酸乙酯，用3 mL 1 mol/L的NaCl溶液溶解萃取出的馬尿酸，在228 nm波長分別測定體系的吸光值，計算差值（△A=A90min-A0min）。以單位時間內吸光值的變化表示ACE活力，抑制劑對ACE的抑制作用按下列公式計算：

式（1）中：Ac為加入超純水時吸光值在90 min內的變化；Ai為加入抑制劑（實驗樣品）時吸光值在90 min內的變化。

1.2.5 統計分析

采用Excel 2019處理實驗數據，以平均值±標準差（Mean±SD）的形式表示。利用Design Expert軟件設計正交實驗方案，數據分析和作圖采用GraphPad Prism生物統計軟件，P＜0.05認為差異有統計學意義。所有實驗數據均重復3次。

2 實驗結果

2.1 鮮牛奶粗蛋白的制備

實驗結果表明，鮮牛奶粗蛋白的抽提率為2.9%，鮮牛奶粗蛋白中蛋白含量為91.6%。因此，鮮牛奶蛋白抽提率為2.65%。

2.2 粗蛋白的堿性蛋白酶解L25（54）正交實驗結果

正交實驗結果見表1。R值分析表明，多肽水解度的影響因素主次順序為pH＞水解時間＞溫度＞酶和底物組成比例。依據k值變化發現，最佳的水解條件組合為：在40 ℃、pH=11、酶和底物組成比例為1∶30的條件下，水解300 min的效果最好，多肽水解度可達到（46.58±0.77）%。

表1 堿性蛋白酶酶解鮮奶粗蛋白的L25（54）正交實驗及多肽水解度和ACEI值

2.3 鮮牛奶粗蛋白酶解物ACEI活性測定

ACEI的結果為（50±0.44）%。見表1。

3 討論

ACEI是生物活性肽研究領域的熱點之一，酪蛋白水解物是ACEI一個重要的制備來源，動物試驗及臨床研究均顯示其具有較好的降血壓作用。

本研究開展了堿性蛋白酶法水解鮮牛奶粗蛋白制備ACEI混合肽的實驗，借助L25（54）正交設計方案最終確定了在溫度為40 ℃、pH=11、酶和底物濃度組合比例為1∶30、水解時間為300 min的條件下可獲得（46.58±0.77）%的多肽水解度，此時ACEI活性為（50±0.44）%。

不同蛋白酶的活性位點不同，同時活力大小也受多方面條件影響，因此牛奶粗蛋白多肽水解產物的成分、活性表現等方面差別也很大。例如張秋會等[15]用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白的最佳條件為pH=7.4、溫度為40 ℃、水解時間為180 min，酶與底物的比例為1 400∶1（U/g）；再有陳旭峰等[16]用胰蛋白酶對牛乳酪蛋白進行水解，在pH為7.5、溫度為50 ℃、酶和底物比例為1∶25、水解時間為120 min的條件下，得到具有抗氧化性的酪蛋白水解物。這些結果說明了酶解實驗的復雜性。

另外，體外有ACEI活性的多肽有可能到體內后失去活性，也有體外ACEI活性不高，而在體內表現出明顯抗壓效果的多肽。因此，針對包括ACEI在內的由鮮牛奶粗蛋白經酶解制備而獲得的功能寡肽中，其體內外活性大小、穩定性等因素還需要做針對性的深入探討，這對乳品產業高附加值科技產品的開發都具有重要意義。