木犀草素固體脂質納米粒的制備及其體內藥動學研究

楊 娟， 尚曙玉， 賈 安， 郭銳稅， 馮永豪

(1.黃河科技學院醫學院，河南 鄭州 450006；2.上海雷允上藥業有限公司，上海 201401)

木犀草素屬于黃酮類化合物，主要來源于白毛夏枯草、裸花紫珠、密蒙花、野菊花等植物中[1]，并且在洋蔥、芹菜等蔬菜中也存在，具有神經保護、抗炎、保肝、抗腫瘤等藥理作用[2-3]，研究價值較高。但該成分口服吸收較差，從而限制了其藥效發揮及臨床應用，故采用新型制劑技術改善其口服吸收生物利用度非常必要。目前，已有包合物、膠束、微乳等制劑學報道[4-6]，但缺少藥動學研究。

固體脂質納米粒是采用單一或混合脂質材料作為載體，將藥物夾嵌或包裹在載體材料中制得的粒徑在50～1 000 nm之間的膠粒給藥系統[7-8]，促進藥物口服吸收效果明顯。本實驗將木犀草素制成該劑型后，對其粒徑、電位、藥物存在狀態、體外溶出進行研究，再考察其體內藥動學，以期為該成分開發利用提供參考。

1 材料

XP205型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；DF-101S型磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；Vortex-2型渦旋振蕩儀(上海滬析實業有限公司)；Nanosep?型超濾離心管(截留相對分子質量10 000，美國Pall公司)；DW-86L328型超低溫冰箱(浙江捷勝低溫設備有限公司)；FD-1A-80型冷凍干燥機(上海豫明儀器有限公司)；GY-GSDCY-24型氮氣吹掃儀(上海歸永電子有限公司)；LS13320XR激光衍射粒度分析儀(美國貝克曼公司)。

木犀草素對照品(批號111751-201812，純度98.9%，中國食品藥品檢定研究院)；香葉木素對照品(批號P0587，上海源葉生物科技有限公司)；木犀草素原料藥(批號P201005，純度98.1%，北京索萊寶生物有限公司)；單硬脂酸甘油酯(批號1521489324-2)、泊洛沙姆188(F-68，批號1815004)(德國巴斯夫公司)；磷脂[PC-98T，輔必成(上海)醫藥科技有限公司]。

SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，體質量(300±20)g，動物生產許可證號SCXK(滬)2012-0003，于溫度25 ℃、相對濕度55%的實驗室中飼養1周后開始實驗。

2 方法與結果

2.1 木犀草素固體脂質納米粒制備 采用乳化蒸發-低溫固化法。取20 mg木犀草素、150 mg單硬脂酸甘油酯、150 mg磷脂，置于20 mL乙醇中，在75 ℃水浴中磁力攪拌加熱溶解，作為有機相；取0.8 g泊洛沙姆188、0.4 g聚山梨酯80，溶于40 mL蒸餾水中，于75 ℃水浴中磁力攪拌(轉速1 000 r/min)加熱溶解，作為水相，將有機相緩慢加到水相中，溫度維持在75 ℃，持續磁力攪拌濃縮至25 mL，迅速置于-4 ℃冰箱中固化，即得。同法制備空白固體脂質納米粒混懸液。

2.2 木犀草素含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)；流動相乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長282 nm；進樣量20 μL。

2.2.2 線性關系考察 稱取木犀草素對照品20 mg，溶于100 mL乙腈中，混勻，得到貯備液(0.2 mg/mL)，取10 mL至100 mL量瓶中，乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)定容至20 μg/mL，稀釋至10、5、1、0.1、0.05 μg/mL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以木犀草素質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=22.057 2X-1.078 6(r=0.999 8)，在0.05～20 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 方法學考察 取1 mL木犀草素固體脂質納米?；鞈乙?，置于10 mL量瓶中，5 mL乙腈超聲處理5 min后定容至刻度，6 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)定容，得到供試品溶液，于0、2、6、12、24 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得木犀草素峰面積RSD為1.34%，表明溶液在24 h內穩定性良好。制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得木犀草素含量RSD為1.52%，表明該方法重復性良好。取0.05 μg/mL(低)、5 μg/mL(中)、20 μg/mL(高)對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得木犀草素峰面積RSD分別為0.41、0.11%、0.12%，表明儀器精密度良好。取9份空白固體脂質納米?；鞈乙焊? mL，分別置于10 mL量瓶中，加入800 μg/mL對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，5 mL乙腈超聲處理5 min后定容至刻度，6 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，乙腈-四氫呋喃-0.1%磷酸二氫鉀(70∶1∶29)定容至刻度，取上清液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得木犀草素平均加樣回收率分別為99.09%、98.83%、100.17%，RSD分別為1.11%、1.69%、0.85%。

2.3 包封率、載藥量測定 取2.0 mL混懸液，置于量瓶中，5 mL甲醇超聲處理5 min后定容至10 mL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣20 μL測定木犀草素總含量m總，另取2.0 mL混懸液至4 mL超濾離心管中(截留分子量為30 kDa)，10 000 r/min離心30 min，在“2.2.1”項色譜條件下進樣20 μL測定游離藥量m游離，計算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(m總-m游離)/m總]×100%、載藥量=[(m總-m游離)/(m總+m脂質)]×100%。結果，3批固體脂質納米粒平均包封率為85.24%，載藥量為5.24%。

2.4 形態觀察 取木犀草素固體脂質納米粒混懸液0.1 mL，加入4 mL蒸餾水混勻，滴于銅網上，2%磷鎢酸染色，自然晾干，置于掃描電鏡(TEM)下拍照，結果見圖1。由此可知，所得納米粒形狀規整，呈類球形或球形，無粘連。

圖1 木犀草素固體脂質納米粒TEM圖Fig.1 TEM image for luteolin solid lipid nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta電位測定 取木犀草素固體脂質納米粒混懸液0.1 mL，加入4 mL蒸餾水混勻后置于比色皿中，測定粒徑、Zeta電位，結果見圖2～3，可知兩者平均值分別為176.35、-33.8 mV。

圖2 木犀草素固體脂質納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of luteolin solid lipid nanoparticles

圖3 木犀草素固體脂質納米粒Zeta電位Fig.3 Zeta potential of luteolin solid lipid nanoparticles

2.6 凍干粉制備及其X射線粉末衍射(XRPD)研究

2.6.1 制備方法 取“2.1”項下木犀草素固體脂質納米粒混懸液，以3%乳糖為凍干劑，混勻后密封，置于-70 ℃超低溫冰箱中預凍2 d，迅速轉移至冷凍干燥機中(-30 ℃)抽真空2 d，于6 h內勻速升溫至25 ℃，取出，即得。復溶后，凍干粉平均粒徑為236.81 nm，Zeta電位為-27.1 mV，包封率為78.85%，載藥量為4.72%，木犀草素質量分數為0.85%。

2.6.2 XRPD 掃描條件為銅靶，管壓40 kV，掃描范圍3°～45°，掃描速度5°/min，分別對木犀草素、空白脂質納米粒凍干粉、物理混合物(木犀草素+空白脂質納米粒凍干粉)、木犀草素固體脂質納米粒進行XRPD掃描，結果見圖4。由此可知，木犀草素圖譜中有許多晶體衍射峰，表明其存在狀態為晶型；空白脂質納米粒凍干粉也出現許多晶體衍射峰；物理混合物中仍可見在4.2°、9.3°處的特征晶體衍射峰；在木犀草素固體脂質納米粒中未發現上述晶型衍射峰，表明木犀草素制成固體脂質納米粒后的存在狀態轉變為無定型。

注：a～d分別為木犀草素固體脂質納米粒、物理混合物、空白脂質納米粒凍干粉、木犀草素。圖4 各樣品XRPD圖Fig.4 XRPD patterns for various samples

2.7 體外釋藥研究 取木犀草素固體脂質納米粒凍干粉1.4 g(含木犀草素10 mg)，加入3 mL溶出介質后轉移至透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)中，兩端扎緊。取木犀草素10 mg，同法制備對照品。以900 mL 1%SDS溶液為釋放介質，溫度、轉速分別設置為37 ℃、100 r/min，于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h各取樣3 mL，取樣后立即補加3 mL 1%SDS溶液，5 000 r/min離心10 min，取上清液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖5，可知原料藥24 h累積溶出度僅為31.9%；固體脂質納米粒釋藥過程分為快速釋藥期(前6 h)和緩慢釋藥期(6 h～24 h)，累積溶出度提高至71.5%。再分別采用Higuchi模型、Weibull模型、零級模型、一級模型對固體脂質納米粒釋藥過程進行擬合，發現Weibull模型擬合度最佳，方程為lnln[1/(1-Mt/M∞)]=0.511lnt-1.336(R2=0.979 2)。

圖5 木犀草素體外釋藥曲線Fig.5 In vitro drug release curves for luteolin

2.8 體內藥動學研究

2.8.1 灌胃液制備 取木犀草素固體脂質納米粒凍干粉0.53 g，0.5%CMC-Na溶液制成1.5 mg/mL混懸液(以木犀草素計)。取木犀草素5 mg，同法制成1.5 mg/mL混懸液。

2.8.2 分組、給藥及血樣采集 12只大鼠采用拋幣法隨機分為2組，按10 mg/kg劑量分別灌胃給予“2.8.1”項下2種灌胃液，乙醚麻醉后于0.15、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12 h立即眼眶取血適量(0.2～0.4 mL)，置于肝素潤濕的離心管中，振蕩后4 000 r/min離心2 min，取上層血漿，冷凍保存。

2.8.3 血漿樣品處理 參考文獻[4,9]報道，精密吸取血漿樣品100 μL至離心管中，加入內標溶液50 μL、 HCl溶液(3 mol/L)200 μL，置于60 ℃水浴中1.5 h，加入150 μL 5%HClO4溶液，振蕩10 min后加入2 mL乙酸乙酯，渦旋5 min，8 000 r/min離心20 min后取出，取上層有機相，45 ℃氮氣吹干得殘渣，加入100 μL流動相復溶。

2.8.4 內標、對照品溶液制備 稱取香葉木素對照品10 mg，溶于100 mL乙腈中(100 μg/mL)，精密量取1 mL至100 mL量瓶中，乙腈定容混勻，精密吸取5 mL至10 mL量瓶中，即得500 ng/mL內標溶液。取“2.2.2”項下貯備液，乙腈依次稀釋至1 500、750、300、100、20 ng/mL，即得對照品溶液。

2.8.5 專屬性、線性關系考察 取1 500、750、300、100、20 ng/mL對照品溶液各100 μL，分別加入50 μL內標溶液，45 ℃氮氣吹干得殘渣，加入大鼠空白血漿100 μL，按“2.8.3”項下方法操作，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖6，可知該方法專屬性良好。以木犀草素質量濃度為橫坐標(X)，木犀草素、內標(香葉木素)峰面積比值為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=1.254 8X+0.102 2(r=0.991 2)，在20～1 500 ng/mL范圍內線性關系良好。

1.木犀草素 2.內標(香葉木素)1.luteolin 2.internal standard (diosmetin)圖6 木犀草素HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of luteolin

2.8.6 方法學考察 取處理后的血漿樣品，于0、4、12、24、48 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得木犀草素、內標(香葉木素)峰面積比值RSD為1.75%，表明溶液在48 h內穩定性良好。以1 500、300、20 ng/mL血漿對照品溶液為高、中、低質量濃度，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得日內精密度RSD分別為6.11%、9.03%、10.56%，日間精密度RSD分別為8.92%、9.93%、11.05%，表明該方法精密度良好。取100 μL空白血漿，依次制成1 500、300、20 ng/mL溶液，在“2.2.1”項色譜條件下各進樣測定3次，測得木犀草素加樣回收率87.14%～97.09%，RSD為10.14%。取20 ng/mL血漿對照品溶液(不含內標)，逐步稀釋后在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得定量限為5 ng/nL，檢測限為 2 ng/mL。

2.8.7 結果分析 圖7、表1顯示，與原料藥比較，固體脂質納米粒tmax延長(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對生物利用度提高至2.28倍。

圖7 木犀草素血藥濃度-時間曲線Fig.7 Plasma concentration-time curves for luteolin

表1 木犀草素主要藥動學參數

3 討論

木犀草素水溶性較低，會發生溶出速率及溶出度受限、脂溶性差、透膜吸收困難、在胃腸道中容易受到酶解等問題[9-10]，導致其口服吸收生物利用度不理想。本實驗將該成分制成固體脂質納米粒后，藥物溶出速率、累積溶出度均得到提高，可能是由于它以無定型狀態存在于納米粒中，有助于溶解度提高；納米載藥系統使其比表面積明顯增加，促進其快速溶出，增加其與胃腸道黏膜的接觸面積[11-14]。另外，藥物包裹于固體脂質納米粒中時可避免與外界環境直接接觸，降低被破壞幾率，提高穩定性，同時納米制劑可改善其滲透性[15]，促進透膜吸收。

文獻[16]報道，木犀草素進入人體后可與血清蛋白相結合，故需使該成分從結合態游離出來。本實驗分別采用HCl、HClO4溶液對蛋白進行水解、沉淀，并以乙酸乙酯提取，藥動學結果顯示，固體脂質納米粒tmax延后，可能是由于納米粒粒徑較小，提高了與胃腸道黏膜的粘附性，增加了在胃腸道中的滯留時間，導致tmax延后；Cmax顯著升高，可能與納米粒特殊吸收機制有關，可使藥物被高效吸收進入血液循環，從而提高其口服生物利用度[17-18]。但固體脂質納米粒促進藥物吸收的程度還會受到納米粒粒徑、納米材料性質、表面活性劑種類、納米粒表面親水親脂性及空間特性、體內穩定性及跨膜吸收過程中諸多因素的影響[13, 18-20]，今后尚需作進一步研究。