小兒解表口服液HPLC特征圖譜建立及4種成分測定

汪 冰， 解盈盈， 薛 菲， 翟士旭， 林永強*

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東省中藥標準創新與質量評價工程實驗室，山東 濟南 250101；2.威海人生藥業集團股份有限公司，山東 濟南 250022)

小兒解表口服液由金銀花、葛根、牛蒡子、黃芩、連翹、蒲公英、紫蘇葉等藥材經提取而成，具有宣肺解表，清熱解毒之功效，臨床主要用于治療小兒外感風熱引起的惡寒發熱、頭痛咳嗽、鼻塞流涕、咽喉痛癢[1-4]。該制劑現行質量控制標準主要是連翹苷、黃芩苷、葛根素的TLC定性鑒別和金銀花中綠原酸定量測定[5]，雖然在一定程度上保障了產品質量，但無法全面反映其質量狀況。因此，本實驗建立小兒解表口服液HPLC特征圖譜，并對隱綠原酸、葛根素、黃芩苷、牛蒡苷含量進行測定，以期從整體上評價該制劑質量[6-15]。

1 材料

Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司，配置二極管陣列檢測器、Empower 2色譜工作站)；CP225D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Milli-Q 超純水系統(美國默克密理博公司)；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(功率500 W，昆山市超聲儀器有限公司)。小兒解表口服液13批，購自威海人生藥業集團股份有限公司，批號分別為20161201(S1)、20161202(S2)、20161203(S3)、0190101(S4)、0190102(S5)、0190103(S6)、0190104(S7)、0190201(S8)、0190202(S9)、0190203(S10)、0190301(S11)、0190302(S12)、0190303(S13)。

綠原酸(批號110753-201314，純度96.6%)、黃芩苷(批號110715-201117，純度91.7%)、葛根素(批號110752-201313，純度95.5%)、連翹苷(批號110821-201615，純度94.9%)、牛蒡苷(批號110819-200606)、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸(批號111894-201102)、咖啡酸(批號110885-200102)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；隱綠原酸對照品(批號MUST-19032403，純度99.07%)購自成都普思生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為Millipore純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.4%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%A；10～35 min，10%～25%A；35～40 min，25%～35%A；40～43 min，35%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長230 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，50%甲醇制成每1 mL分別含綠原酸45.24 μg、隱綠原酸33.00 μg、咖啡酸5.04 μg、葛根素20.38 μg、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸41.56 μg、黃芩苷97.03 μg、連翹苷14.80 μg、牛蒡苷69.63 μg的溶液，即得。

2.2.2 對照藥材溶液 取蒲公英、金銀花、紫蘇葉、葛根、黃芩、連翹、牛蒡子對照藥材各0.1 g，25 mL 50%甲醇超聲處理30 min，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液 精密量取口服液2 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按制劑處方和工藝，分別制備缺蒲公英、缺金銀花、缺葛根、缺黃芩、缺連翹、缺牛蒡子、缺紫蘇葉陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.3 特征圖譜方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取樣品(S1)，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，所得色譜圖中1～8號峰以綠原酸為參照，9～13號峰以黃芩苷為參照，測得13個共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.5%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取樣品(S1)，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，所得色譜圖中1～8號峰以綠原酸為參照，9～13號峰以黃芩苷為參照，測得13個共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均分別小于0.5%、1.5%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取樣品(S1)，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，所得色譜圖中1～8號峰以綠原酸為參照，9～13號峰以黃芩苷為參照，測得13個共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均分別小于0.5%、1.0%，表明溶液在25 h內穩定性良好。

2.4 圖譜生成 按“2.2.3”項下方法制備13批樣品的供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012年版)對其色譜圖進行分析(圖1)，選擇重復性、分離度較好，可歸屬到處方藥味的13個色譜峰作為共有峰。由于共有峰在圖譜中主要分布于前后部分，較為分散，故以保留時間適中、峰面積較大、分離度較好的2號峰(綠原酸)、10號峰(黃芩苷)為參照，保留時間在25 min前的1～8號峰選擇前者，25 min后的9～13號峰選擇后者，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表1～2。

圖1 13批樣品HPLC特征圖譜Fig.1 Characteristic HPLC chromatograms of thirteen batches of samples

表1 共有峰相對保留時間

表2 共有峰相對峰面積

2.5 共有峰相對保留時間規定值確定 以綠原酸為參照峰1，計算前8個共有峰的相對保留時間；以黃芩苷為參照峰2，計算后5個共有峰的相對保留時間。以13批樣品HPLC特征圖譜中13個共有峰的相對保留時間平均值為規定值，分別為0.93(峰1)、1.00(峰2)、1.15(峰3)、1.40(峰4)、1.50(峰5)、1.86(峰6)、1.94(峰7)、2.32(峰8)、0.87(峰9)、1.00(峰10)、1.04(峰11)、1.07(峰12)、1.16(峰13)，并且偏差均應在±5%以內。由表2可知，8個共有峰相對峰面積RSD較大(>10%)，故只規定共有峰相對保留時間，而不規定其相對峰面積。

2.6 共有峰指認及歸屬 通過與對照藥材溶液、陰性樣品溶液色譜峰進行比較，可判定1號色譜峰來自蒲公英，2號色譜峰為金銀花、蒲公英、牛蒡子的共有峰，3號色譜峰來自金銀花，4號色譜峰為蒲公英、紫蘇葉的共有峰，5～8號色譜峰來自葛根，9號色譜峰為金銀花、蒲公英的共有峰，10、13號色譜峰來自黃芩，11號色譜峰來自連翹，12號色譜峰來自牛蒡子。再進行對照品定位及紫外光譜比較，確定峰2為綠原酸，峰3為隱綠原酸，峰4為咖啡酸，峰5為葛根素，峰9為4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸，峰10為黃芩苷，峰11為連翹苷，峰12為牛蒡苷。色譜圖見圖2。

2.7 計量學分析

2.7.1 相似度計算 將13批樣品數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，以對照特征圖譜為參照，進行共有峰匹配后計算相似度，結果見表3，可知均高于0.98，表明各批樣品之間差異較小。

表3 13批樣品相似度

2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.咖啡酸 5.葛根素 9.4,5-O-二咖啡酰奎寧酸 10.黃芩苷 11.連翹苷 12.牛蒡苷2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4.caffeic acid 5.puerarin 9.isochlorogenic acid C 10.baicalin 11.phillyrin 12. arctiin圖2 各成分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituens

2.7.2 聚類分析 通過SPSS19.0軟件，以13個共有峰峰面積為變量，采用組間聯接系統聚類法中的歐氏距離對13批樣品進行聚類分析，結果見圖3。由此可知，各批樣品大致分為2類，S1～S3聚為一類，生產日期為2016年；S4～S13聚為另一類，生產日期為2019年。

圖3 13批樣品聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis plot for thirteen batches of samples

2.8 各成分含量測定

2.8.1 溶液制備

2.8.1.1 對照品溶液 精密稱取各對照品，50%甲醇制成每1 mL分別含牛蒡苷0.208 89 mg、黃芩苷0.291 09 mg、葛根素0.030 57 mg、隱綠原酸0.099 0 mg的溶液，即得。

2.8.1.2 供試品溶液 精密量取口服液2 mL，置于50 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.8.2 方法學考察

2.8.2.1 線性關系考察 取“2.8.1.1”項下對照品溶液，50%甲醇稀釋(牛蒡苷0.013 93、0.034 82、0.069 63、0.104 45、0.139 26、0.174 08、0.208 89 mg/mL，黃芩苷0.019 41、0.048 52、0.097 03、0.145 55、0.194 06、0.242 58、0.291 09 mg/mL，葛根素0.002 04、0.005 10、0.010 19、0.015 29、0.020 38、0.025 48、0.030 57 mg/mL，隱綠原酸0.006 6、0.016 5、0.033 0、0.049 5、0.066 0、0.082 5、0.099 0 mg/mL)，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程分別為牛蒡苷Y=1.768 0×107X-5.531 9×104(r=0.999 9)、黃芩苷Y=1.731 1×107X-4.899 7×104(r=1.000 0)、葛根素Y=3.038 2×107X-1.910 9×104(r=1.000 0)、隱綠原酸Y=1.399 1×107X-2.297 0×104(r=0.999 9)，分別在0.013 93～0.208 89、0.019 41～0.291 09、0.002 04～0.030 57、0.006 6～0.099 0 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.8.2.2 精密度試驗 取“2.8.2.1”項下各成分第3個質量濃度的對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸峰面積RSD分別為1.16%、0.92%、0.89%、1.03%，表明儀器精密度良好。

2.8.2.3 重復性試驗 取樣品(S1)，按“2.8.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸含量RSD分別為1.10%、0.37%、0.23%、0.66%，表明該方法重復性良好。

2.8.2.4 穩定性試驗 取供試品溶液(S1)，于0、5、10、15、20、25 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸峰面積RSD分別為0.86%、0.12%、0.42%、1.12%，表明溶液在25 h內穩定性良好。

2.8.2.5 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的樣品6份(S1)，按“2.8.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，每份精密量取1 mL至50 mL量瓶中，精密加入對照品溶液[牛蒡苷(0.208 9 mg/mL)5 mL、黃芩苷(0.242 6 mg/mL)10 mL、葛根素(0.101 9 mg/mL)3 mL、隱綠原酸(0.099 0 mg/mL)5 mL]，50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.8.3 樣品含量測定 取13批樣品，按“2.8.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下各進樣10 μL測定，外標法計算含量，結果見表5。

表5 各成分含量測定結果(mg/mL，n=3)

3 討論

3.1 檢測波長選擇 本實驗采用二極管陣列檢測器對8種成分的紫外吸收光譜進行掃描，發現在230 nm下色譜峰數目較多，而且除黃芩苷外均有較好的吸收；該處波長雖為黃芩苷較低吸收，但可減少與其他色譜峰的差異，同時各成分色譜峰峰形、分離度均較好。因此，選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 耐用性考察 本實驗考察了4種色譜柱(Agilent Extend-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；依利特Hypersil BDS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；Thermo BDS Hypersil C18，5 μm, 250 mm×4.6 mm；Thermo ODS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm)，其中Agilent Extend、Thermo BDS Hypersil色譜柱重復性較好。然后，對新購買的、使用不同年限的色譜柱進行，發現其重復性均較好。

3.3 HPLC特征圖譜分析 對13批小兒解表口服液進行聚類分析，發現不同生產年限樣品分別聚為一類，推測可能是由于原料受生長環境、采收時間、加工貯存等因素的影響；另一方面，口服液長時間放置容易出現沉淀，會帶來穩定性方面的問題，隱綠原酸等酚酸類成分易分解轉化[16-17]，而黃芩苷等黃酮類成分溶解性較差，也可能影響穩定性。另外，相同生產年限的不同批次樣品雖然個別共有峰略有差異，但其質量基本穩定。

4 結論

本實驗建立了小兒解表口服液HPLC特征圖譜，確定了13個共有峰，通過與對照藥材比對歸屬了方中7個藥味，再與對照品比對指認了其中8種成分，發現13批樣品相似度均大于0.98，表明特征圖譜能較全面反映制劑整體狀況。同時，建立了專屬性較強的牛蒡苷、黃芩苷、葛根素、隱綠原酸含量測定方法，可為小兒解表口服液的質量控制提供參考依據。