UPLC法同時(shí)測定白虎湯中4種成分

景夢曉， 呂邵娃， 付婷婷， 劉紫衡， 李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

白虎湯出自《傷寒論》，由石膏、知母、甘草、粳米4味藥材組成，功效清熱瀉火、除煩生津，是治療陽明熱證的經(jīng)典方劑，在解熱、抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、抗痛風(fēng)、降血糖、降脂、減輕腫瘤治療不良反應(yīng)、抑制皮脂腺增生等方面均有作用[1-3]。目前，對(duì)白虎湯含量測定的研究主要集中在不同配伍條件對(duì)某些成分的影響[4-9]，但只測定某一成分的含量；另外有采用HPLC法測定方中4種成分的含量[10]，但該方法檢測時(shí)間較長，分離度低。因此，本實(shí)驗(yàn)建立UPLC法同時(shí)測定白虎湯中芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨的含量，而且該方法取樣量少，簡單快速，靈敏度和分離度高，可為有效控制該方質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 炙甘草(批號(hào)170201)、石膏(批號(hào)SAO251)(安徽廣印堂中藥股份有限公司)；知母(批號(hào)20160512，北京本草方源藥業(yè)有限公司)；粳米為市售。芒果苷(DST180513-010)、新芒果苷(DST180630-017)、甘草酸銨(DST180422-012)、甘草苷(DST180321-014)對(duì)照品均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度均>98%。乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純；水為屈臣氏飲用水。

1.2 儀器 ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SB-5200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)；ATGL-16C-高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；煎煮鍋(潮州市順創(chuàng)陶瓷有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得(質(zhì)量濃度分別為0.32、0.32、0.1、0.4 mg/mL)。

2.2 供試品溶液制備 取知母6兩(93.75 g)、甘草2兩(31.25 g)、粳米6合(120 mL)，置于1斗(1 981 mL)水中浸泡30 min，加入生石膏(碎)1斤(250 g)后一起轉(zhuǎn)入砂鍋中，武火煮沸后轉(zhuǎn)至文火煎煮40 min，4層紗布趁熱過濾得到湯液約850 mL。取1 mL，50%甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，超聲處理30 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液約2 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%～10%B；1～3 min，10%～14%B；3～5 min，14%～18%B；5～6 min，18%B；6～9 min，18%～19%B；9～12 min，19%～55%B；12～15 min，55%～62%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長256 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 精密移取對(duì)照品、供試品溶液各1 μL，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分峰形完整，分離度高，表明該方法專屬性良好。

1.新芒果苷 2.芒果苷 3.甘草苷 4.甘草酸銨1.mangiferin 2.neomangiferin 3.liquiritin 4.ammoniumglycyrrhizinate圖1 各成分UPLC色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 取芒果苷對(duì)照品溶液，甲醇稀釋至40、60、80、160、320、640 μg/mL；取新芒果苷對(duì)照品溶液，甲醇稀釋至60、80、160、320、640、1 280 μg/mL；取甘草苷對(duì)照品溶液，甲醇稀釋至10、25、50、100、150、200 μg/mL；取甘草酸銨對(duì)照品溶液，甲醇稀釋至40、65、80、100、200、400 μg/mL。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取上述4種供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.91%、2.42%、3.00%、1.37%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于配制后0、2、4、6、8、10 h在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD分別為1.82%、1.32%、1.16%、1.19%，表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD分別為2.89%、1.89%、2.72%、1.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取湯劑6份，每份0.5 mL，加入0.5 mL對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 樣品含量測定 取飲片6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長篩選 本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度計(jì)，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)對(duì)照品、供試品溶液均在256 nm處有最大吸收峰，故選擇其作為檢測波長。

3.2 檢測指標(biāo)篩選 白虎湯中粳米含有大分子多糖類物質(zhì)，在PDA檢測器無法被檢出[11]；石膏作為礦物藥，其主要成分為含水硫酸鈣，在該檢測器也無法被檢出[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇知母、甘草所含主要成分作為檢測指標(biāo)。

3.3 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了HPLC、UPLC法，并通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)出峰時(shí)間、分離度、檢測靈敏度進(jìn)行分析，最終選擇UPLC法，相比于HPLC法可大大縮短分析時(shí)間，提高效率，減少溶劑消耗[13-15]。

此外，前期已有報(bào)道采用UPLC法測定白虎湯中指標(biāo)成分含量，但采用等度洗脫，而且僅限于1種成分，無法全面反映該方質(zhì)量，故本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，不僅縮短了分析時(shí)間，還使得4種成分色譜峰均達(dá)到了較好的分離度。此外，在分離色譜峰時(shí)為了得到分離度好、峰形完整的色譜峰，本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入了適量甲酸，既抑制了白虎湯中水溶性酸性成分的分解，又得到了理想的色譜峰峰形。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC法同時(shí)測定白虎湯中芒果苷、新芒果苷、甘草苷、草酸銨的含量，發(fā)現(xiàn)該方法較HPLC法更簡便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性更好，可為該方后期進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。