半夏瀉心湯及不同配伍組對慢性胃炎大鼠ICC細胞相關受體表達和鈣內流的影響

周澤華， 紀萬里， 安 叡， 梁 琨， 王新宏

(上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203)

慢性胃炎是一種常見的、多發性的消化系統疾病，病變分布不均勻。主要由炎性細胞(淋巴細胞和漿細胞為主)浸潤所導致的胃黏膜慢性炎癥或萎縮性病變，也可同時存在中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤。該病的發病率逐年上升，且有隨著年齡的增長而升高的趨勢[1]。目前西醫治療以對癥處理為主，暫無特效藥物，而中藥治療顯示出明顯優勢，中醫強調辨證論治，從整體觀念出發調整機體狀態[2]。中醫學并無“慢性胃炎”病名，根據本病的主要臨床表現將其劃分為“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇。本病以脾虛為本，痰濁、瘀血、濕熱為標，為本虛標實之證。疾病日久即可因虛致實，又可因實致虛，導致虛實夾雜，同時多種致病因素又可郁久化熱，表現出寒熱錯雜的臨床癥狀[3]。半夏瀉心湯出自張仲景的《傷寒論》，是治療寒熱錯雜之心下痞的代表方劑之一，具有和中降逆，開痞散結之功，臨床上主要治療急慢性胃炎。

Cajal間質細胞(interstitial cells of Caja，ICC)作為胃腸道慢波的起搏細胞，是基本電節律的主要傳播者，參與了慢波的傳導，同時也是胃腸神經與平滑肌細胞聯系的重要通道，參與了胃腸神經信息傳遞過程，在胃腸動力的調控中起著十分重要的作用，與胃腸動力性疾病的發病密切相關。ICC的功能結構異常改變、發育分化障礙、凋亡或自噬引起胃腸道起搏電位、慢波節律和興奮傳導的異常，是多種胃腸道疾病發生的關鍵機制[4]。既往研究表明[5]慢性胃炎與胃腸功能的障礙有一定關聯，文獻[6]報道，半夏瀉心湯具有調節胃腸道作用，但從半夏瀉心湯的配伍角度來研究作用機制的文獻較少。中藥配伍理論是中醫藥理論的精華之一，開展方劑配伍規律的現代研究有利于闡釋中藥復方對疾病的多靶點治療作用，同時也有助于臨床療效的提高及應用的推廣。因此，本實驗研究半夏瀉心湯及各配伍組對胃腸道運動相關受體的影響，同時，通過觀察半夏瀉心湯及各配伍組含藥血清對ICC細胞內Ca2+濃度的影響，探究半夏瀉心湯調節慢性胃炎胃腸道功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質量160～180 g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(滬)2014-0008，飼養環境溫度(22±0.5)℃，相對濕度(50±5)%，12 h/12 h光照/黑暗交替。實驗前，所有大鼠適應性飼養7 d，自由進食飲水。

1.2 試劑與藥物 半夏瀉心湯組方藥材黃連、黃芩、人參、甘草、半夏、干姜、大棗均購自上海康橋中藥飲片有限公司，經上海虹橋中藥飲片有限公司陳燕軍藥師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》規定。伊托必利(迪沙藥業集團有限公司)；兔抗5-羥色胺4受體(5-HT4)、兔抗多巴胺D2受體(DA2)、兔抗乙酰膽堿酯酶(AchE)多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；小鼠抗c-kit多克隆抗體(上海圣克魯斯生物技術有限公司)；羊抗兔HRP標記二抗、羊抗鼠HRP標記二抗、Fluo-4-AM、Western blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；兔抗GAPDH多克隆抗體(美國CST公司)；M199培養基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；干細胞因子(SCF)、Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)；青鏈霉素混合液(100X)、D-hanks(美國Solarbio公司)；逆轉錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)；SYBR Green PCR試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo公司)。

1.3 儀器 TDZ4-WS離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；BHC-1300IIB2生物安全柜(蘇州金凈凈化設備公司)；Thermo Forma 3111CO2恒溫培養箱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；T100 PCR儀(美國Bio-Rad公司)；7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)；Eclipse Ni熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；SP8 激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥液制備 按全方半夏、干姜、黃芩、黃連、人參、大棗、炙甘草12∶9∶9∶3∶9∶6∶9比例，加入10倍量水煎煮45 min，共2次，濾過，合并濾液，濃縮至生藥量1.0 g/mL。按比例稱取各配伍組飲片，包括辛開組(半夏、干姜)，苦降組(黃芩、黃連)，甘補組(人參、炙甘草、大棗)，同法煎煮。

1.4.2 動物分組 70只大鼠遵循隨機分配原則分為正常組、模型組、全方組、苦降組、辛開組、甘補組、陽性藥(伊托必利)組，每組10只。

1.4.3 造模及給藥 空白組大鼠灌胃給予生理鹽水，其余各組大鼠建立寒熱錯雜型慢性胃炎大鼠模型。采用苦寒瀉下法[7]，大承氣湯按10 g/kg劑量灌胃，隔天1次，連續10 d，第11天開始灌胃給予含4%辣椒的56%乙醇混懸液，劑量8 mL/kg，每3 d 1次，連續9 d，復制熱證模型[8]。造模成功后大鼠灌胃給藥(依照人單位體質量生藥量來求得大鼠單位體質量生藥量, 并擴大3倍)，分別為全方組15 g/kg、苦降組3 g/kg、辛開組5.5 g/kg、甘補組6.5 g/kg、陽性藥組40 mg/kg，而正常組、模型組大鼠每天灌胃給予等劑量生理鹽水，均連續7 d。

1.4.4 標本采集及處理 大鼠按0.4 mL/100 g劑量腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉，分離胃部并沿胃長緣剪開，生理鹽水洗去胃內容物，濾紙吸干，4%多聚甲醛固定，使組織細胞中的蛋白變性并固化，進行病理學檢查。另取胃組織，RT-qPCR法檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kitmRNA表達，Western blot法檢測蛋白表達。

1.4.5 HE染色 將在4%多聚甲醛中固定過夜的大鼠胃組織放到包埋盒中，自來水沖洗6 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片(約4 μm厚)，脫蠟至水，進行HE染色，在光鏡下觀察其形態學。

1.4.6 RT-qPCR法檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kitmRNA表達 取凍存的各組大鼠部分胃組織，按照說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR儀對5-HT4、AchE、DA2、c-kit進行相對定量分析，目標基因通過2-△△CT公式計算，引物序列由上海基爾頓生物科技有限公司設計，見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.7 Western blot檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白表達 取凍存的各組大鼠胃組織，稱定質量，置于2 mL離心管中，按1∶10比例加入RIPA裂解液，機械勻漿1 min，10 000×g離心5 min，取上清，BCA法定量，SDS-PAGE電泳分離，轉膜，5%BSA室溫下封閉1 h，加入5-HT4(1∶500)、AchE(1∶500)、DA2(1∶300)、c-kit(1∶500)，4 ℃過夜，TBST洗膜，加入HRP標記的二抗(1∶1 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發光試劑盒檢測，凝膠成像系統拍照，以GAPDH為內標，檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白的相對表達量。

1.4.8 免疫熒光法檢測5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白共表達 將各組大鼠胃組織切片在二甲苯中浸泡，脫蠟后切片，浸入梯度乙醇中脫二甲苯，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，正常山羊血清封閉，37 ℃下放置30 min，滴加兔抗大鼠5-HT4(1∶500)、AchE(1∶500)、DA2(1∶300)抗體、小鼠抗大鼠c-kit抗體(1∶500)，置于濕盒中，4 ℃下過夜，取出切片，37 ℃下復溫60 min，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，免疫熒光雙標記滴加羊抗兔HRP標記二抗、羊抗鼠HRP標記二抗(1∶1 000)，37 ℃下放置40 min，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，100 g/L緩沖甘油封固，在熒光顯微鏡下觀察拍照，并記錄熒光強度值。

1.4.9 ICC細胞分離與培養 大鼠禁食18 h后腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，無菌條件下取胃竇組織，4 ℃預冷的D-hanks液反復沖洗胃內容物，胃竇組織剪成1 cm3左右小塊，將呈糜狀者移入離心管中，加3 mL 4%Ⅱ型膠原酶充分吹勻，37 ℃下消化30 min，1 000 r/min離心3 min，棄去上清，加入D-hanks液反復吹打10 min，再離心棄上清，加入M199基礎培養基應用液重懸沉淀，過200目網篩去除大塊組織，將所得懸液加到等體積Ficoll溶液中，離心，取中間沉淀，加到M199培養基中，細胞計數后將其接種至6孔板上，37 ℃、5% CO2下培養24 h后換液，每隔2～3 d 1次，細胞穩定培養7 d后進行后續研究。

1.4.10 ICC細胞鑒定 細胞穩定培養后，0.02 mol/L PBS洗去培養基，4%甲醛固定30 min，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，0.5% TritonX-100通透10 min，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，1%BSA封閉1 h，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，加入小鼠抗c-kit多克隆抗體(1∶500)，置于濕盒中，4 ℃下孵育過夜，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，滴加羊抗鼠HRP標記二抗(1∶1 000)，置于濕盒中孵育，室溫下放置1 h，0.02 mol/L PBS緩沖液沖洗，防淬滅封片劑與DAPI(1∶500)稀釋封片，置于-20 ℃冰箱中保存，熒光顯微鏡拍片。

1.4.11 含藥血清制備 將60只大鼠隨機分為空白血清對照組、全方組、苦降組、辛開組、甘補組、陽性藥組，灌胃給藥量與“1.4.3”項下相同，連續7 d，處死，腹主動脈取血，12 000×g高速離心，取上清液，56 ℃下滅活，-80 ℃下保存備用。

1.4.12 細胞分組及給藥 取對數生長期的ICC細胞，稀釋成1×105個/mL單細胞懸液，接種于96孔培養板上，每孔0.1 mL，每組設3個復孔，RPMI 1640培養基常規培養24 h，隨機分為正常組(25%空白血清)、模型組(NO 30 μmol/L)、全方組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、苦降組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、辛開組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、甘補組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)、陽性藥組(NO 30 μmol/L+25%含藥血清)。

1.4.13 Ca2+含量測定 將各組ICC細胞加到0.2 mL 5 μmol/L Fluo-4-AM中，37 ℃下避光孵育 30 min，吸出染液，D-Hanks液沖洗3次，加入0.2 mL D-Hanks液，Fluo-4-AM溶液處理5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，設定激發波長為488 nm，發射波長為522 nm，采樣頻率為488 Hz，每皿選3～5個視野及4個形態良好的細胞，采ZEN blue edition 2.5軟件進行熒光強度分析，以熒光強度增高的比值來衡量鈣含量變化。

2 結果

2.1 大鼠胃組織HE染色 造模后，大鼠胃組織固有層-黏膜下-漿膜層有淋巴細胞浸潤，肌層散在少量淋巴細胞，黏膜下水腫，固有層少許充血，為慢性淺表性胃炎(非萎縮性)的典型癥狀，表明模型建立成功。給藥后，全方組、辛開組、苦降組、甘補組、陽性藥組大鼠癥狀明顯好轉，胃黏膜表面上皮細胞受損、炎細胞浸潤狀況較模型組明顯減輕，胃腺排列稍整齊平整, 黏液增厚且腺管構造逐漸規則。見圖1。

圖1 各組大鼠胃組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of rat gastric tissues in various groups(×200)

2.2 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kitmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組AchE、5-HT4、c-kitmRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)，DA2 mRNA表達升高(P<0.01)，表明模型建立成功；與模型組比較，全方組及各配伍組能不同程度提高AchEmRNA表達(P<0.05，P<0.01)，降低DA2 mRNA表達(P<0.01)，以全方組及甘補組更明顯；全方組可提高5-HT4、c-kitmRNA表達(P<0.05，P<0.01)；除辛開組可提高5-HT4 mRNA表達(P<0.01)外，其他各配伍組均無明顯變化(P>0.05)，表明半夏瀉心湯及配伍組可調節大鼠胃腸動力，有利于恢復其正常功能。見圖2。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kit mRNA表達的影響Fig.2 Effects of Banxia Xiexin Decoction on mRNA expressions of 5-HT4, AchE, DA2 and

2.3 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白表達的影響 模型組大鼠胃組織中AchE蛋白表達與正常組比較降低(P<0.05)，而全方組及配伍組可提高其蛋白表達(P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠胃組織中5-HT4蛋白表達降低(P<0.01)，而全方組及配伍組可提高其蛋白表達(P<0.05，P<0.01)，以全方組和辛開組更明顯(P<0.01)；DA2蛋白表達升高(P<0.05)，而全方組及配伍組可降低其蛋白表達(P<0.05，P<0.01)，以全方組更明顯(P<0.01)；c-kit蛋白表達降低(P<0.01)，而全方組及配伍組可升高其蛋白表達(P<0.01)。見圖3。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 半夏瀉心湯對5-HT4、AchE、DA2、c-kit蛋白表達的影響Fig.3 Effects of Banxia Xiexin Decoction on protein expressions of 5-HT4, AchE, DA2 and

2.4 半夏泄心湯對5-HT4/AchE/DA2、c-kit蛋白共表達的影響 與正常組大鼠比較，模型組大鼠胃組織5-HT4、c-kit熒光強度水平降低，經全方組及配伍組干預后明顯升高(圖4A)；AchE熒光強度水平低于正常組，而全方組及配伍組能提高其水平，同時還可提高c-kit熒光強度值(圖4B)；DA2熒光強度高于正常組大鼠，出現了DA2/c-kit蛋白共表達，而全方組及配伍組可降低其熒光強度(圖4C)。

圖4 各組5-HT4(A)、AchE(B)、DA2(C)與c-kit蛋白共表達Fig.4 Co-expressions of 5-HT4 (A), AchE (B), DA2 (C) and c-kit protein in various groups

2.5 ICC細胞形態及鑒定 穩定培養7 d后，在倒置顯微鏡下可見ICC細胞呈三角形、梭形或多邊形、核大，周圍充滿胞漿，胞體發出多條大小不等的樹枝狀突起，突起與周圍細胞的胞體和突起相互連接，見圖5。免疫熒光染色后，細胞表面c-kit呈綠色陽性顯性，胞體和突起均明顯熒光染色，見圖6。

圖5 光鏡下ICC細胞形態Fig.5 Morphologies of ICC cells under light microscope

圖6 熒光顯微鏡下ICC細胞形態Fig.6 Morphologies of ICC cells under fluorescencemicroscope

2.6 半夏瀉心湯全方對ICC鈣流的影響 與正常組比較，模型組ICC細胞鈣離子熒光強度增強(P<0.05)；與模型組比較，全方組及配伍組能降低ICC內鈣離子熒光強度(P<0.05，P<0.01)，以全方組更明顯(P<0.01)，表明全方組及各配伍組能不同程度抑制ICC鈣離子內流的作用。見圖7。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖7 各組ICC細胞中Ca2+的Fluo-4-AM熒光染色及熒光強度值Fig.7 Fluo-4-AM fluorescence staining and fluorescence intensity of Ca2+ in ICC cells in various

3 討論

ICC被稱為胃腸動力的“起搏者”和“調節者”[9]，c-kit表達是在胃腸肌ICC中存在的主要標志物[10]。ICC中上述受體與胃腸神經系統釋放的神經遞質和肽類物質結合，將神經信息傳送給平滑肌細胞，從而調控胃腸道平滑肌的舒縮是ICC細胞發揮功能的主要機制之一。本研究發現，半夏瀉心湯及不同配伍可通過調節AchE、5-HT4、DA2及c-kit的mRNA表達、蛋白表達，達到改善慢性胃炎的目的。其中，全方組在調節各受體及c-kit的mRNA和蛋白表達方面的效果皆極顯著，這與之前的研究結果相符[11-14]。其他各配伍組間效果則較為接近。其中，辛開組可極顯著提高5-HT4的mRNA和蛋白表達，推測是由于組中半夏和干姜均屬味辛性溫的中藥，而此前王鵬等[15]發現，溫熱性中藥能夠上調大鼠血清5-HT的作用。苦降組和甘補組則能極顯著提高AchE的mRNA表達，可能源于苦降組中黃芩與黃連，據報道[16]，黃芩可使大鼠血清中乙酰膽堿(Ach)升高，進而增加Ach水解酶AchE的活性。黃連則可提高大鼠外周組織中乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活性而間接增強AchE的活性。此外，甘補組能極顯著提高AchE的mRNA表達的原因，可能與人參具有提高AchE活性的作用有關[17]。

ICC細胞還可通過起搏胃腸道慢波產生自發電節律變化并參與慢波的傳導發揮功能。本研究顯示，半夏瀉心湯及各配伍組能不同程度降低ICC細胞內Ca2+的熒光強度，其中全方組效果較各配伍組更好。提示半夏瀉心湯及各個配伍組可通過降低ICC細胞內的Ca2+濃度，抑制ICC鈣超載，防止ICC興奮節律失常，從而調節胃腸道運動，與文獻[14]報道相符。

ICC的兩個功能間可能也具有一定的關聯性。如胃腸道的5-HT4可激活腺苷環化酶[18]，黃棪等[19]就曾發現，旋覆代赭湯可使5-HT4表達增加，促進cAMP釋放，打開電壓門控鈣通道，最終使胞內Ca2+濃度升高。至于半夏瀉心湯降低ICC細胞內的Ca2+濃度并調節胃腸道神經遞質的進一步機制，以及ICC細胞內Ca2+與這些神經遞質之間是否也存在類似的關聯性，還有待深入研究。