基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究梔子抗缺血性腦卒中的分子機(jī)制

孫 瑜， 蔡 媛， 沈冰冰， 李鵬輝， 鄧天好， 彭艷梅

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006)

缺血性腦卒中是腦卒中的一種常見(jiàn)類型，占腦卒中總數(shù)的85%[1]，隸屬于中醫(yī)中風(fēng)范疇。“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說(shuō)認(rèn)為中風(fēng)主要因?yàn)闄C(jī)體邪氣郁積日久而化熱，生風(fēng)動(dòng)血，以熱毒侵犯腦絡(luò)所致，主張以清熱解毒法治療中風(fēng)[2-3]。梔子是茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的成熟果實(shí)，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載梔子“味苦，性寒，主五內(nèi)邪氣，胃中熱氣”，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，梔子具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝利膽、降血糖、降血壓等作用[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)梔子在臨床上治療缺血性腦卒中應(yīng)用廣泛，含有梔子的中藥復(fù)方有很多，如清開(kāi)靈注射液[5]、醒腦靜注射液[6]、天麻鉤藤飲[7]、安宮牛黃丸[8]、黃連解毒膠囊[9]、治郁顆粒[10]等。目前關(guān)于梔子在缺血性腦卒中的藥理作用研究開(kāi)展比較廣泛，大量研究表明梔子中活性成分對(duì)于缺血性腦卒中有預(yù)防和保護(hù)作用，其機(jī)制包括抗氧化應(yīng)激[11]、抗凋亡[12]、保護(hù)血腦屏障等[13]。然而，這些研究都是單一或主要指標(biāo)成分針對(duì)單一靶標(biāo)或單一通路，對(duì)于梔子治療缺血性腦卒中活性成分整體作用的分子機(jī)制還不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在組學(xué)數(shù)據(jù)分析、虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索基礎(chǔ)上的生物信息網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析策略，其系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀相吻合[14]。近年來(lái)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用促進(jìn)了中藥從“單一靶點(diǎn)、單一成分”向“多靶點(diǎn)、多組分”的轉(zhuǎn)變，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、闡述中藥治療作用整體機(jī)制提供了新手段。本文旨基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法分析梔子治療缺血性腦卒中的分子機(jī)制，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論參考。其具體流程分析見(jiàn)圖1。

圖1 梔子治療缺血性腦卒中的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接分析流程圖Fig.1 Network pharmacology and molecular docking flowchart of Gardeniae Fructus in treatment for cerebral ischemic stroke

1 方法

1.1 梔子中活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái) (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，以口服生物利用度(oral bioavailabity,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的2個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)屬性值進(jìn)行梔子活性成分及其作用靶標(biāo)篩選，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物及其已知靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)將化合物作用靶標(biāo)進(jìn)行基因名的轉(zhuǎn)化和規(guī)范。

1.2 梔子治療CIS相關(guān)靶點(diǎn)的獲得 利用Gene Cards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Ischemic stroke”、“Cerebral ischemia”、“Cerebral ischemic stroke”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到CIS發(fā)病過(guò)程已知靶點(diǎn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中將疾病基因靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。利用Venny 2.1(http://bionfoggp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制梔子活性成分與CIS相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖，并獲得交集靶點(diǎn)。

1.3 “疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 將“1.1”“1.2”項(xiàng)下活性成分、靶點(diǎn)及疾病關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中“節(jié)點(diǎn)”(node)表示藥物、分子、靶點(diǎn)、疾病，“邊”(edge)表示節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系。采用network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以度值(degree)大小反映節(jié)點(diǎn)大小，介數(shù)值(betweenness)反映邊粗細(xì)，從而明確梔子中抗CIS較為重要的成分及相互作用力度。

1.4 梔子治療CIS蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)得到的疾病與梔子有效成分的交集靶點(diǎn)，利用STRING平臺(tái)(物種選擇Homosapiens)建立PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入Cytoscape軟件中，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅贸龆戎?degree)和緊密值(combined scores), 以度值大小反映節(jié)點(diǎn)的大小和顏色，緊密值反映邊的粗細(xì)和顏色，再利用MCODE插件和CytoHubba插件得出網(wǎng)絡(luò)中連接最為緊密的子網(wǎng)絡(luò)和核心靶點(diǎn)。

1.5 GO、KEGG富集分析 利用Metascape(https://metascape.org/)輸入交集靶點(diǎn)，對(duì)GO Biological Process、GO Molecular Function、GO Cellular Component、KEGG Pathway進(jìn)行全面富集，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的功能分布，設(shè)定P<0.01。

1.6 分子對(duì)接 從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)中以物種選擇為Homosapiens、蛋白分辨率為2.0～3.0為條件，搜索并下載血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelia growth factor A，VEGFA)、絲裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL6)的3D結(jié)構(gòu)PDB格式文件。利用MOE軟件對(duì)蛋白進(jìn)行優(yōu)化(去水、加氫、計(jì)算電荷、能量最小化等)后與從TCMSP中下載的小分子(mol 2格式)進(jìn)行對(duì)接，選取結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol[15]者作為梔子抗缺血性腦卒中的活性成分篩選依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的梔子成分及其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的相關(guān)檢索，共搜集到活性成分98種。同時(shí)，根據(jù)OB和DL參數(shù)結(jié)合文獻(xiàn)[16-19]對(duì)梔子活性成分進(jìn)行篩選，共搜集到入血活性成分17種，見(jiàn)表1。利用相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)對(duì)上述活性成分進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，排除重復(fù)靶點(diǎn)，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范，共獲得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)97個(gè)。

表1 梔子中活性成分

2.2 CIS相關(guān)基因及其與梔子活性成分相關(guān)的靶點(diǎn) 利用Gene Card、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Ischemic stroke”、“Cerebral ischemia”、“Cerebral ischemic stroke”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，分別發(fā)現(xiàn)4 333、101個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將疾病基因靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范，得到總靶點(diǎn)數(shù)4 409個(gè)。通過(guò)Venny 2.1在線工具繪制梔子活性成分靶點(diǎn)與CIS相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖，并得到交集靶點(diǎn)共80個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖2 梔子活性成分靶點(diǎn)與缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets for active constituents of Gardeniae Fructus and cerebral ischemic stroke-related targets

2.3 “疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型 通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)共獲得94個(gè)節(jié)點(diǎn)和237個(gè)關(guān)系，如表2、圖3所示。

表2 梔子治療缺血性腦卒中的活性成分

圖3 “疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Disease-constituents-targets network diagram

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)篩選 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network, PPI network)見(jiàn)圖4A。由于PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)的相互關(guān)系復(fù)雜程度不同，存在著部分復(fù)雜程度較高的區(qū)域(dense regions)，是PPI網(wǎng)絡(luò)中潛在的子網(wǎng)絡(luò)，其連線密度較高，具有重要生物學(xué)意義，故再利用Cytoscape軟件中的MCODE插件及過(guò)分子復(fù)合物檢測(cè)算法對(duì)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，比較score大小得到region，見(jiàn)圖4B。為了更加精確地找到梔子抗缺血性腦卒中的核心靶點(diǎn)，通過(guò)CytoHubba插件進(jìn)行MCC運(yùn)算，得到核心靶點(diǎn)，其中前十個(gè)見(jiàn)圖5。

圖4 梔子-缺血性腦卒中靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(A)及其靶點(diǎn)子網(wǎng)絡(luò)(B)Fig.4 Gardeniae Fructus-cerebral ischemic stroke stroke target PPI network(A) and its target subnet(B)

圖5 按MCC法排名的前10個(gè)靶點(diǎn)Fig.5 Top 10 targets ranked by MCC method

2.5 GO、KEGG富集分析 Metascape平臺(tái)擁有全面的注釋功能，并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料[20- 21]，本研究采用該平臺(tái)對(duì)梔子治療缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，結(jié)果如圖6所示。由此可知，梔子治療缺血性腦卒中主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)(cellular response to hormone stimulus)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、對(duì)異源生物刺激的反應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)、對(duì)酮的反應(yīng)(response to ketone)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)(cellular response to nitrogen compound)、凋亡信號(hào)通路(apoptotic signaling pathway)。相關(guān)靶點(diǎn)治療缺血性腦卒中的功能主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、激酶結(jié)合(kinase binding)、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)等。主要參與的細(xì)胞組分包括膜筏(membrane raft)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物(plasma membrane protein complex)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(transcription factor complex)等。

圖6 GO功能分析Fig.6 GO function analysis

另外，梔子治療缺血性腦卒中涉及的通路包括液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、MAPK、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、VEGF信號(hào)通路、血小板活化(platelet activation)等，見(jiàn)圖7、表3。

圖7 KEGG富集分析前20條通路Fig.7 Top 20 channels by KEGG enrichment analysis

表3 KEG富集分析結(jié)果

2.6 梔子有效成分與VEGFA、MAPK8、IL6的分子對(duì)接 將12種有效成分與核心靶點(diǎn)VEGFA、MAPK8、IL6所對(duì)應(yīng)的蛋白復(fù)合晶體進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)圖8，可知VEGFA與亞油酸乙酯、藏紅花酸、β-谷甾醇的結(jié)合能最小，MAPK8與京尼平苷、亞油酸乙酯、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮的結(jié)合能最小，IL6與亞油酸乙酯、豆甾醇、京尼平苷的結(jié)合能最小。綜上所述，MOL001494(亞油酸乙酯)、MOL001406(藏紅花酸)、MOL000358(β-谷甾醇)、MOL004557(京尼平苷)、MOL003095[5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮]、MOL000449(豆甾醇)與VEGFA、MAPK8、IL6結(jié)合較好，其分子對(duì)接模型見(jiàn)圖9。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果Fig.8 Results of molecular docking

圖9 分子對(duì)接的最優(yōu)復(fù)合結(jié)構(gòu)及相互作用Fig.9 Optimal composite structures and interactions of molecular docking

3 討論

本研究通過(guò)構(gòu)建“疾病-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行拓?fù)浞治觯驳玫綏d子治療CIS的12個(gè)核心成分，即藏紅花酸、京尼平、歐前胡素、梔子苷、蘇丹紅三、槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、亞油酸乙酯、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮、異山柰素，這些化合物均有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[22-25]，說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法中篩選參數(shù)及模型構(gòu)建合理。根據(jù)degree值可知槲皮素、山柰酚作用靶點(diǎn)最多，說(shuō)明槲皮素和山柰酚在梔子治療CIS發(fā)揮重要作用。楊冉等[26]研究表明槲皮素通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障具有保護(hù)作用。此外，山柰酚[27]可通過(guò)抑制TLR4和NF-κB來(lái)減少炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平從而改善大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)功能。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯瑮d子治療CIS的核心靶點(diǎn)包括VEGFA、MAPK8、IL6等。其中，VEGFA是一種促血管生成因子，主要富集于VEGF信號(hào)通路，David 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFs在腦損傷和缺氧的雙重刺激下，VEGF 能通過(guò)促進(jìn)缺血半暗帶內(nèi)殘存毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移來(lái)促進(jìn)血管的新生。MAPK8是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[29]，該類激酶在腦缺血損傷中和缺血性神經(jīng)元損傷中發(fā)揮重要作用。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，梔子治療CIS與液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、MAPK、NF-κB、VEGF、血小板活化等信號(hào)通路相關(guān)，其大致可分為3個(gè)功能模塊：①抗炎機(jī)制，其中NF-κB信號(hào)通路中的NF-κB為下端的關(guān)鍵分子，對(duì)炎性因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起著直接調(diào)控作用，抑制NF-κB通路可以阻止促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[30]。②動(dòng)脈粥樣硬化等血流速和血管相關(guān)機(jī)制。顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化是CIS的常見(jiàn)誘因。晚期動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)導(dǎo)致血小板活化、血管收縮、血栓形成，引發(fā)血流動(dòng)力學(xué)，并導(dǎo)致CIS的形成。③綜合調(diào)控機(jī)制，如MAPK信號(hào)通路，其主要由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、氨基末端激酶、p38 MAPK 和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶54條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成[31]。p38 MAPK通路中p38不僅參與炎癥反應(yīng)，還與缺血缺氧、炎癥因子、內(nèi)毒素、高滲透壓、牽張和剪切應(yīng)力等細(xì)胞應(yīng)激時(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[32]。進(jìn)一步選取PPI核心靶點(diǎn)VEGFA、MAPK8、IL6分別與12個(gè)核心成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示12個(gè)成分與3個(gè)靶點(diǎn)之間都有較好的結(jié)合能力，說(shuō)明這12個(gè)核心成分可以直接與關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用，均為梔子治療CIS的潛在成分。

綜上所述，本研究以梔子為研究對(duì)象，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)其治療CIS潛在的作用成分、靶標(biāo)及通路，并結(jié)合分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證成分與靶標(biāo)的相互作用，從系統(tǒng)層面闡釋了梔子治療CIS具有多成分-多靶點(diǎn)-多通路的作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步探討和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化等提供了重要參考依據(jù)。