UHPLC-MS/MS法對人參和枸杞配伍中皂苷類成分定性和定量分析

黃仁嵩， 王和宇， 焦傳新， 李 慧， 焦麗麗， 劉淑瑩， 吳 巍

(長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117)

人參PanaxginsengC.A.Mey.大補元氣，復脈固脫，是一種珍貴藥材[1-2]，人參皂苷是其主要活性成分，具有抗衰老、提高免疫力等藥理作用[3]，其結構可分為原人參二醇型、原人參三醇型和齊墩果酸型[4]。枸杞LyciumbarbarumL.具有抗腫瘤、抗衰老等藥理作用, 主要活性成分為枸杞多糖[5]。傳統中醫認為，合理的配伍可以達到減毒增效的效果[6]。人參和枸杞應用廣泛，兩者配伍可用于治虛勞、下焦虛傷、微渴、小便數(出自《圣惠方》枸杞子散)；現代研究表明，二者配伍可以增加療效[7-9]。目前，對于人參和枸杞的配伍研究較少，大多為藥效分析，而中藥配伍后成分通常會發生變化[10]，因此建立一個快速穩定的分析方法非常重要。質譜法因其靈敏度高、分析速度快、樣品用量少，正成為一種強有力的分析工具[11-14]。UHPLC-ESI-LTQ MS可以短時間內同時實現母離子、子離子的采集和多級質譜碎裂，提高對中藥復雜體系中化學成分的快速鑒定與分析能力[15-18]。

本研究通過UHPLC-ESI-LTQ MS法對人參和枸杞配伍后人參皂苷結構進行系統的定性和定量分析，并測定兩者在不同煎煮方式下人參皂苷的含量變化，以期為該藥對質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；FA2004A分析天平(上海精天電子儀器有限公司)；FDU-1100冷凍干燥機(日本EYELA儀器公司)；粉碎機(德國IKA集團)；Agilent RRLC色譜儀(美國Agilent公司)；LTQ XL質譜，配備雙噴霧ESI源、自動校準系統。

1.2 試劑與藥物 對照品人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1、Rg3、Rf、Rd、R1購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，純度96%，美國Tedia公司)；Milli-Q超純水(18.2 MΩ/cm)；其他試劑均為分析純。人參購于吉林撫松，枸杞購于北京福永源飲片有限公司，均經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定為正品，保存于長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取對照品人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1、Rg3、Rf、Rd、R1各1 mg，80%甲醇溶解制備成1 mg/mL溶液，精密移取適量于2 mL量瓶中，80%甲醇定容，制備成對照品溶液，質量濃度分別為15、5、1、10、3、15、5、2、8、2 μg/mL，即得。

2.1.2.1 人參枸杞共煎液 稱取人參粗粉10 g、枸杞75 g，加入30倍量水，80 ℃水浴，提取2次，每次90 min，提取前室溫浸泡1 h，3 500 r/min離心10 min，合并濾液，去除沉淀，60 ℃水浴濃縮，凍干，得到共煎液總皂苷提取物31.853 4 g，收率約為10.73%。精密稱定共煎液中總皂苷提取物5 mg，80%甲醇定容至5 mL量瓶中，稀釋為質量濃度為400 μg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2.2 人參枸杞合并液 稱取人參粗粉10 g、枸杞75 g，分別進行單煎實驗，加入30倍量水，80 ℃水浴提取2次，每次90 min，提取前室溫浸泡1 h，3 500 r/min離心10 min，合并濾液，去除沉淀，60 ℃水浴濃縮，凍干，得合并液總皂苷提取物，精密稱定5 mg，80%甲醇溶解定容至5 mL量瓶中，稀釋為質量濃度400 μg/mL的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 測定方法

2.2.1 色譜條件 C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，20%B；5～8 min，20%～30%B；8～40 min，30%～40%B；40～45 min，40%～90%B；45～47 min，90%B；47～50 min，90%～20%B；50～55 min，20%B)；體積流量0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

2.2.2 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)；負離子模式；噴霧電壓3.0 kV；透鏡電壓100 V；毛細管電壓32 V；質量掃描范圍m/z100～2 200；鞘氣體積流量30.0 L/min；輔助氣體積流量10.0 L/min; 毛細管溫度320 ℃。

2.3 UHPLC-MS定性分析 在“2.2”項條件下，得到10種人參皂苷對照品的總離子流色譜圖，見圖1，可知均基本達到基線分離，在人參枸杞提取物中均被檢測出。人參皂苷在負離子模式下的UHPLC-MS TIC 譜圖見圖2。通過化合物的保留時間、精確的質核比和串聯質譜，鑒定了人參中20種人參皂苷。由于以0.1%甲酸溶液作為流動相，在負離子模式全掃描質譜圖中均給出[M-H]-準分子離子和[M+HCOO]-加合離子峰，為確定人參皂苷的質核比提供了有用的信息。通過MS/MS特征碎片離子分析和精確質量測定，分析了化合物苷元類型和取代糖鏈序列，見表1。碎片離子的命名采用Costello命名法。

2.3.1 結果分析 圖1～2顯示，在上述色譜條件下人參枸杞提取物得到很好的分離。為進一步確定化合物的結構，分別對峰1～20進行了串聯質譜分析，通過化合物的保留時間，精確分子量，質核比(m/z)和串聯質譜圖確定了20個人參皂苷化合物，見表1。以三醇型人參皂苷Re和二醇型人參皂苷Rc為例，闡述人參枸杞提取物中人參皂苷的串聯質譜，見圖3。

圖1 10種人參皂苷的UHPLC-MS TIC圖Fig.1 UHPLC-MS TIC chromatogram of ten ginsenosides

表1 人參枸杞配伍中人參皂苷的碎片離子

圖2 人參枸杞共煎液中人參皂苷負離子模式下UHPLC-MS圖Fig.2 UHPLC-MS chromatogram of ginsenosides in P. ginseng-L. barbarum mixed decoction under negative ion mode

圖3 人參皂苷相關圖譜Fig.3 Related spectra of ginsenosides

對峰11中[M+HCOO]-離子m/z1 123進行二級串聯質譜分析，產生碎片離子m/z1 077，其為母離子[M+HCOO]-丟失甲酸根產生的[M-H]-，再對[M-H]-離子m/z1 077進行三級串聯質譜分析，見圖4，產生碎片離子m/z945、m/z783、m/z621、m/z459，母離子[M-H]-丟失Ara(132 Da)殘基產生離子m/z945(Y1α)，進一步丟失Glc殘基(162 Da)產生離子m/z783(Y0α)，表明化合物在α位為一分子Glc和一分子Ara取代，隨后又丟失Glc殘基(162 Da)產生離子m/z621(Y1β)，進一步丟失Glc殘基(162 Da)產生二醇型苷元的特征離子m/z459(Y′0β)，表明化合物在β位為兩分子Glc取代，推測峰11為人參皂苷Rc。

圖4 人參皂苷Rc質譜圖Fig.4 Mass spectra of ginsenoside Rc

對峰2中[M+HCOO]-離子m/z991進行二級串聯質譜分析，產生碎片離子m/z945，其為母離子[M+HCOO]-丟失甲酸根產生的[M-H]-，再對[M-H]-離子m/z945進行三級串聯質譜分析，見圖5，產生碎片離子m/z783、m/z637、m/z475，母離子[M-H]-丟失Glc殘基(162 Da)產生離子m/z783 (Y0α)，表明Glc為末端取代糖，進一步丟失Rha殘基(146 Da)產生離子m/z637(Y′1β)，表明化合物有1個Glc和1個Rha取代，隨后丟失Glc殘基(162 Da)產生離子m/z475(Y′0β)，離子m/z475為三醇型苷元的特征離子，推斷峰2為人參皂苷Re。

圖5 人參皂苷Re質譜圖Fig.5 Mass spectra of ginsenoside Re

前期研究表明，人參皂苷在負離子模式下有更好的響應值，在負離子模式下對人參皂苷母離子及多級質譜碎裂進行采集，獲得碎片峰的m/z，根據化合物精確的相對分子質量、碎片峰信息，對20種人參皂苷進行準確的鑒定分析。人參皂苷經ESI源離子化以后,大多數在二級質譜的負離子模式下形成[M-H]-和[M+HCOO]-的準分子離子峰。在三級質譜中，人參皂苷類成分容易發生側鏈糖苷鍵的斷裂。人參二醇型皂苷、人參三醇型皂苷的裂解主要都發生糖苷取代基的斷裂產生去糖基化離子，如人參皂苷Rc在三級串聯質譜中產生[M-H-Ara(f)]-、[M-H-Ara-Glc]-等去糖基化離子。而由于母核的不同，人參二醇型皂苷和人參三醇型皂苷在裂解過程中會產生m/z459、m/z475特征碎片離子，可區分不同種類的人參皂苷。

2.4 UHPLC-MS定量分析

2.4.1 線性關系考察 取對照品溶液，在“2.2”項條件下進樣2、4、6、8、10 μL各3次。以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各人參皂苷線性關系

2.4.2 精密度試驗 取供試品溶液，在“2.2”項條件下連續進樣6次，考察日內精密度；連續3 d同法測定，考察日間精密度。結果，10種人參皂苷的日內精密度RSD在1.08%～2.34%之間，日間精密度RSD在0.97%～2.81%之間，表明該儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.2”項條件下進樣，測得10種人參皂苷RSD在1.39%～3.08%之間，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取人參枸杞提取物6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣，測得10種人參皂苷峰面積RSD在0.91%～2.76%之間，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取含量已知的人參枸杞提取物6份，加入上述10種對照品溶液(質量濃度均為1 mg/mL)各100 μL，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣，測得10種人參皂苷RSD在0.75%～2.77%之間。

2.4.6 樣品含量測定 取供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣5 μL，重復6次，結果見表3。人參枸杞共煎液中總多糖質量分數為425.08 mg/g，提取率為42.58%。

表3 各人參皂苷含量測定結果

3 討論

本實驗結果表明，人參枸杞共煎與分別單煎相比，人參皂苷R1、Re、Rf、Rb2、Rb3、Rd、Rg3含量下降，人參皂苷Rg1、Rb1、Rc含量上升，其中以人參皂苷Rb1增加最多，為88.9%，人參皂苷Rg1、Rc也分別增加了8.23%、23.6%，表明在共煎過程中主要成分的溶出會相互影響。現代研究表明，人參枸杞配伍使用具有更好的抗疲勞、補腎壯陽等作用[7,9]，同時溶出增加的人參皂苷Rb1具有提高免疫力活性[19]，人參皂苷Rg1具有抗疲勞、抗衰老等活性[20],人參皂苷Rc具有抗炎、抗氧化等活性[21]，這符合中藥配伍的“增效”理論。本研究從人參皂苷含量變化的角度證明了人參枸杞配伍的科學性，可為相關應用提供參考。