不同栽培模式對4年生黃精主要化學(xué)成分積累的影響

吳康靖， 王飛鳳， 常 暉， 梁宗鎖， 楊青文， 馬存德， 賈巧君*

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018；3.步長制藥集團(tuán)科研部，陜西 西安 712000)

黃精PolygonatiRhizoma為百合科黃精屬的塊狀根莖，2020年版《中國藥典》[1]收錄3種(滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl、黃精PolygonatumsibiricumRed.、多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua)。現(xiàn)代藥理研究表明，黃精具有提高免疫力、降血糖、降血脂、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗衰老、改善記憶力、改善骨質(zhì)疏松等作用[2]。

畢研文等[3]分析了蘋果套種、遮陽網(wǎng)遮陰栽培等4種栽培模式對黃精產(chǎn)量和多糖含量的影響，發(fā)現(xiàn)蘋果套種模式下兩者最高，40%遮陽網(wǎng)栽培模式下最低。樊艷榮等[4]研究發(fā)現(xiàn)，林下植被的群落結(jié)構(gòu)對黃精生長存在影響，毛竹林下生長和人工栽培的黃精根莖中主要化學(xué)成分含量差異較小，但存在季節(jié)性差異。不同黃精種質(zhì)和生長年限對主要化學(xué)成分的積累規(guī)律也存在影響，多年生黃精中1年生和2年生齡節(jié)多糖含量高，3年生和4年生齡節(jié)次之，其后降低[5-6]；5年生多花黃精中的多糖含量也隨齡節(jié)增加而降低[7]；6年生黔產(chǎn)黃精根莖中多糖含量隨年份呈先增后減變化趨勢，其4年生齡節(jié)中最高[8]；10年生安徽產(chǎn)黃精的多糖含量隨生長年限呈上升趨勢，9年生齡節(jié)最高，其后降低[9]。綜上所述，黃精主要化學(xué)成分的積累受到生長年限、生態(tài)環(huán)境、種質(zhì)以及栽培方式的影響。

陜西省略陽縣是黃精道地產(chǎn)區(qū)，步長制藥集團(tuán)已在略陽縣九龍洞鎮(zhèn)建立了黃精GAP生產(chǎn)基地。劉佩[10]通過測定黃精多糖和薯蕷皂苷元含量，確定3、6年生黃精最佳采收時(shí)間分別為8、10月，因此不同生長年限黃精的最佳采收時(shí)間是不同的。黃精最佳采收年限為3～4年[11]，本研究分析了大田套種玉米和林下仿野生撫育2種栽培模式下4年生黃精化學(xué)成分積累規(guī)律，以期為陜西略陽地區(qū)黃精的栽培模式和適宜的采收期提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)。葡萄糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；蘆丁、沒食子酸、薯蕷皂苷元(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)。所有試劑均為分析純(杭州高晶精細(xì)化工有限公司)。

1.2 藥材 取自陜西省略陽縣步長集團(tuán)黃精GAP基地大田套種玉米和林下仿野生撫育種植的4年生黃精。4月至10月期間，每月15日采收大田套種玉米和林下仿野生撫育的完整黃精植株，用于測定多糖、黃酮、總酚和薯蕷皂苷元含量。

1.3 方法 黃精根莖、莖、葉洗凈晾干后稱定質(zhì)量，然后將黃精根莖切成約3 mm厚的薄片，105 ℃殺青0.5 h，55 ℃將根莖、莖、葉烘干至恒重后稱定質(zhì)量，打成粉末備用。

1.3.1 多糖含量測定 參照文獻(xiàn)[6]，取黃精粉末約1.0 g，精密稱定，按料液比1∶20加水浸沒，水浴2.5 h，離心，取上清液，用無水乙醇調(diào)節(jié)乙醇至80%，低溫醇沉過夜，離心棄上清，加水溶解，混勻，采用硫酸-蒽酮法測定多糖含量。

1.3.2 黃酮含量測定 參照文獻(xiàn)[12]，取黃精粉末約1.0 g，精密稱定，按料液比1∶10加50%乙醇溶解，超聲提取1 h，提取3次，濾過，用50%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，取0.3 mL樣品溶液，采用硝酸鋁顯色法測定黃精總黃酮含量。

1.3.3 總酚含量測定 參照文獻(xiàn)[13]，取黃精粉末約1.0 g，精密稱定，按料液比1∶10加入70%乙醇，超聲提取30 min，濾過，濾液反復(fù)提取3次，70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，取 0.3 mL樣品溶液，采用福林酚顯色法測定黃精總酚含量。

1.3.4 薯蕷皂苷元含量測定 參照文獻(xiàn)[14]，取黃精粉末約1.0 g，精密稱定，按料液比1∶25加入80%乙醇，冷凝回流4 h，離心取上清，蒸干乙醇，殘?jiān)? mol/L鹽酸80 mL，進(jìn)一步沸水回流水解4 h，冷卻，移至分液漏斗中，加氯仿萃取3次，合并氯仿液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙猓浦? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，采用RP-HPLC測定薯蕷皂苷元含量。

分析采用Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相水-乙腈；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min;檢測波長200 nm；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

1.薯蕷皂苷元1.diosgenin圖1 薯蕷皂苷元HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of diosgenin

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程Y=570 377.64X+64 168.90(r=1.000 0),在4～20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4 數(shù)據(jù)分析 利用 Microsoft Excel365軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析、顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期黃精的多糖含量比較 4年生黃精的多糖含量、變化動(dòng)態(tài)見圖2。多糖主要存在于根莖，2種栽培模式下多糖含量均在8月達(dá)到最大值，6月含量最低，其中大田套種玉米的黃精根莖中的多糖含量為8.26%～22.87%，林下仿野生撫育黃精根莖中的多糖含量為6.46%～18.53%，其含量隨時(shí)間總體呈“增-減-增-減”變化趨勢；4、5、6、8、9月大田套種玉米的黃精根莖中多糖含量顯著高于林下仿野生撫育黃精；10月林下仿野生撫育黃精根莖中多糖含量比大田套種玉米黃精根莖中含量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；莖和葉中多糖含量較少，莖中多糖含量最大值出現(xiàn)在9月；葉中多糖含量除4月含量較低外，其余月份中多糖含量相對平穩(wěn)；10月大田套種玉米的黃精回苗，故無地上部分?jǐn)?shù)據(jù)。

注:相同月份大田和林下比較,*P<0.05,**P<0.01。圖2 多糖含量動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of polysaccharide content

2.2 不同時(shí)期黃精的黃酮含量比較 4年生黃精的黃酮分布、變化動(dòng)態(tài)見圖3。黃酮主要分布于葉中，2種栽培模式下黃酮含量最高值均出現(xiàn)在4月，之后逐月降低；林下仿野生撫育黃精葉中黃酮含量始終高于大田套種玉米黃精葉中黃酮含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；大田套種玉米的黃精葉中黃酮含量在6.74～26.87 mg/g范圍內(nèi)，林下仿野生撫育的黃精葉中黃酮含量在11.90～57.09 mg/g范圍內(nèi)；根莖中黃酮含量最高值出現(xiàn)在8月，其中大田套種玉米的黃精根莖中最高含量為34.93 mg/g，林下仿野生撫育的黃精根莖中最高含量為25.85 mg/g；含量隨時(shí)間總體呈現(xiàn)“增-減-增-減”變化趨勢；2種栽培模式下莖中黃酮含量在10 mg/g左右，動(dòng)態(tài)趨勢較為平穩(wěn)。

注:相同月份大田和林下比較,*P<0.05,**P<0.01。圖3 黃酮含量動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of flavonoids content

2.3 不同時(shí)期黃精的總酚含量比較 4年生黃精的總酚分布、變化動(dòng)態(tài)見圖4。總酚主要分布于葉，莖次之；大田套種玉米的黃精葉中總酚含量在14.88～30.73 mg/g范圍內(nèi)，而林下仿野生撫育的黃精葉中總酚含量在13.66～32.11 mg/g范圍內(nèi)，均在4月最高，7月最低，隨時(shí)間推移呈“V”型變化趨勢；大田套種玉米的黃精莖中總酚含量在7.95～17.75 mg/g范圍內(nèi)，呈“減-增-減-增”變化趨勢，而林下仿野生撫育的黃精莖中總酚含量在6.61～14.97 mg/g范圍內(nèi)，呈“減-增-減”變化趨勢；大田套種玉米和林下仿野生撫育的黃精根莖中總酚含量總體呈“W”型變化趨勢，6月出現(xiàn)峰值，7月明顯下降后回升，前者增幅高于后者。

注:相同月份大田和林下比較,*P<0.05,**P<0.01。圖4 總酚含量動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of total phenol content

2.4 不同時(shí)期黃精的薯蕷皂苷元含量比較 大田套種玉米的黃精根莖中薯蕷皂苷元含量在0.20～0.86 mg/g，林下仿野生撫育黃精根莖中薯蕷皂苷元含量在0.29～1.19 mg/g；林下仿野生撫育的黃精根莖中薯蕷皂苷元含量略高于大田玉米套種，6、7、8月存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；2種栽培模式下皂苷含量呈現(xiàn)先增后減趨勢，7月達(dá)到最大值。見圖5。

注:相同月份大田和林下比較,*P<0.05,**P<0.01。圖5 薯蕷皂苷元含量的動(dòng)態(tài)含量變化Fig.5 Dynamic changes of diosgenin content

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，多糖主要積累于根莖，這與梁永富[15]、張澤銳等[16]報(bào)道一致；2種栽培模式下根莖中多糖均呈 “先增后減”的變化趨勢，在8月達(dá)到最大值，與劉佩[10]報(bào)道的6年生黃精根莖中多糖成分積累規(guī)律一致；與3年生黃精根莖多糖積累規(guī)律存在差異，表明不同生長年限的黃精多糖積累存在差異；云南多花黃精根莖中多糖[17]與浙江多花黃精[18]積累規(guī)律一致，在9月時(shí)含量最高。綜上所述，黃精根莖中多糖均呈先增后減的趨勢，但最大值出現(xiàn)的時(shí)間不同，可能是由生長年限和種質(zhì)不同造成。

2種栽培模式下黃酮和總酚主要分布于葉，莖次之，根莖中含量相對較少，這與金銀花[19]和黃蜀葵[20]中黃酮分布情況一致。4月時(shí)葉中黃酮和總酚含量最高，提示剛萌芽的葉片含有較多的黃酮和總酚[21]。金則新[22]、吳爰爰等[23]研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光照會(huì)破壞植物光合系統(tǒng)，減少黃酮和總酚的合成，短期遮陰栽培能提高地上部分黃酮含量，但長期遮陰栽培不利于黃酮的積累[24-25]，會(huì)減少產(chǎn)物向下運(yùn)輸?shù)谋壤齕15]，這可能是林下仿野生黃精葉中黃酮含量總是高于大田套種玉米黃精的原因[15]，而莖和葉中總酚含量較高，推測總酚的合成積累主要趨于地上部分[26]。

2種栽培模式下根莖中薯蕷皂苷元含量增長趨勢基本一致，均在7月達(dá)到最大值，接著出現(xiàn)明顯的下降。3年生黃精和6年生黃精中薯蕷皂苷元含量積累也呈現(xiàn)為先增后減的變化趨勢，但最高含量分別出現(xiàn)在10月和8月[10]，說明生長年限對薯蕷皂苷元積累存在一定程度的影響。毛竹林下多花黃精根莖中薯蕷皂苷元也呈“先增后減”的變化趨勢，但最大含量出現(xiàn)在9月[27]，表明種質(zhì)和生態(tài)環(huán)境均對薯蕷皂苷元積累存在影響。

綜合分析根莖中主要化學(xué)成分含量，發(fā)現(xiàn)大田套種玉米種植優(yōu)于林下仿野生撫育種植；除6月外，2種栽培模式下多糖含量均符合《中國藥典》要求，故2種栽培模式皆可。然而如今土地資源匱乏，種植土地資源進(jìn)一步銳減，林下種植黃精將成為一個(gè)趨勢[28]，而且以60%透光條件種植黃精為宜[29]。根據(jù)《中國藥典》對黃精品質(zhì)的要求，將多糖作為主因素并綜合考慮其他化學(xué)成分，最佳采收時(shí)期為8月中下旬。

本研究明確了大田套種玉米和林下仿野生栽培模式下4年生黃精中主要化學(xué)成分動(dòng)態(tài)積累規(guī)律，初步確定了4年生黃精最佳采收期。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)黃精莖和葉中黃酮和總酚含量較高，可為該藥材地上資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。