復方肉蓯蓉酒提取工藝的優化

郭小莉， 高如意， 許明君， 劉文英， 柏偉榮

(江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001)

復方肉蓯蓉保健酒由管花肉蓯蓉、紅景天、西洋參、枸杞4味中藥組成。方中肉蓯蓉補腎氣，養精血；紅景天補氣健脾；西洋參補氣養陰，清熱生津，加強紅景天益氣之功；佐以補肝腎益精血之枸杞，諸藥合用，平補陰陽，調養五臟，溫而不燥，補而不膩，無陰陽偏盛之弊，共奏補腎填精益氣之功效，具有緩解體力疲勞、增強免疫力的雙重保健功效。

保健酒是指以釀造酒、蒸餾酒或食用酒精為酒基，以中藥材為原材料，利用萃取、浸提等技術，得到中藥有效成份進而配制所得的具有一定保健功能的本品[1]，它是否具有保健功能，中藥材有效成分的提取是關鍵。本實驗以復方肉蓯蓉保健酒中君藥肉蓯蓉[2]的功效成分松果菊苷、毛蕊花糖苷，紅景天中紅景天苷及產品中總皂苷為指標，采用層次分析法(AHP)結合CRITIC法計算權重系數，求出綜合評分，正交試驗優化該方提取工藝，以期在保證其功效的基礎上為后續相關開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；LC-20AT液相色譜儀、UV-2700型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；XP6、MS-105DU電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑與藥物 松果菊苷(純度89.7%，批號111670-201706)、毛蕊花糖苷(純度92.5%，批號111530-201713)、紅景天苷(純度98.8%，批號110818-201709)、人參皂苷Re(純度97.4%，110754-201626)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。管花肉蓯蓉購自新疆北達蓯蓉生物科技有限公司，紅景天購自亳州市國一堂中藥飲片有限公司，西洋參購自云南白藥文山七花有限責任公司，枸杞購自江蘇國蘇中藥材有限公司，經檢驗均符合2015年版《中國藥典》一部規定。乙腈、甲醇為色譜純，購自美國天地公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 松果菊苷、毛蕊花糖苷含量測定 參考文獻[3-4]報道。

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品適量，置于棕色量瓶中，50%甲醇溶解定容至刻度，即得(松果菊苷、毛蕊花糖苷質量濃度分別為1.676 5、0.629 mg/mL)。

2.1.2 供試品溶液制備 精密量取本品1 mL至2 mL量瓶中，50%甲醇溶解定容至刻度，超聲處理15 min，50%甲醇定容至刻度，離心，取上清液，即得。

2.1.3 色譜條件 Intersustain Swift C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～30 min，15%～27%A；30～40 min，27%A)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長330 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.松果菊苷 2.毛蕊花糖苷圖1 松果菊苷、毛蕊花糖苷HPLC色譜圖

2.1.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液5 mL，置于10 mL棕色量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，逐級稀釋，分別吸取10 μL，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程分別為松果菊苷Y=12 282 607.55X+429 234.77(R2=0.999 2)，線性范圍0.052 4～1.676 5 mg/mL；毛蕊花糖苷Y=16 956 179.10X+64 108.76(R2=0.999 5)，線性范圍0.019 7～0.629 0 mg/mL。

2.1.5 精密度試驗 取供試品溶液及“2.1.4”項下對照品溶液DZ1、DZ4、DZ6，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得DZ1、DZ4、DZ6中松果菊苷峰面積RSD分別為0.23%、0.44%、0.31%，毛蕊花糖苷分別為0.44%、0.54%、0.52%，而供試品溶液中兩者峰面積RSD分別為0.10%、0.16%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 精密吸取“2.1.4”項下對照品溶液DZ4及供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得2種溶液中松果菊苷峰面積RSD分別為0.76%、0.23%，毛蕊花糖苷分別為1.42%、0.18%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取本品適量，按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得松果菊苷、毛蕊花糖苷含量RSD分別為1.45%、1.40%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 按照供試品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的100%水平，取對照品溶液適量于2 mL棕色量瓶中，氮吹至干，加入本品0.5 mL，平行6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，松果菊苷、毛蕊花糖苷平均加樣回收率分別為100.32%、99.42%，RSD分別為1.70%、1.85%。

2.2 紅景天苷含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取紅景天苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.852 mg該成分的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取本品1 mL，置于2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲處理20 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.2.3 色譜條件 參考文獻[5-6]報道。Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；體積流量1 mL/min；流動相乙腈(A)-0.3%磷酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，3%～5%A；20～40 min，5%A)；柱溫35 ℃；檢測波長275 nm；進樣量5 μL。色譜圖見圖2。

1. 紅景天苷圖2 紅景天苷HPLC色譜圖

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，甲醇逐級稀釋并定容至刻度，分別吸取5 μL，注入高效液相色譜儀，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=10 534 278.65X+334 643.51(R2=0.999 8)，線性范圍0.027～0.852 mg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.4”項下同一份對照品、供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得2種溶液中紅景天苷峰面積RSD分別為0.57%、0.98%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取“2.2.4”項下同一份對照品、供試品溶液，于0、2、4、8、12、16、20、24 h在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，測得2種溶液中紅景天苷峰面積RSD分別為0.49%、1.05%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取本品適量，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，測得紅景天苷含量RSD為1.45%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 按照供試品溶液中紅景天苷含量的100%水平，取對照品溶液(0.419 1 mg/mL)0.2 mL，置于2 mL棕色量瓶中，加入本品0.5 mL，平行6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，紅景天苷平均加樣回收率為101.48%，RSD<3%。

2.3 總皂苷含量測定 參考文獻[7]報道。

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Re對照品適量，甲醇制成每1 mL含2 mg該成分的溶液，搖勻，即得。取100 μL至蒸發皿中，置于60 ℃水浴中揮干，加1 mL純化水溶解，10 mL注射器作為層析柱，內裝3 cm AmerLite-XAD-2大孔樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。先用25 mL 70%乙醇洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，將1.0 mL對照品溶液加入層析柱中，先用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液于蒸發皿中，置于60 ℃水浴再揮干，用于顯色。

2.3.2 供試品溶液制備 取本品適量，離心，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，37%乙醇定容至刻度，搖勻，吸取1 mL，置于水浴中揮干，1 mL水溶解殘渣，進行柱層析，以下操作同“2.3.1”項。

2.3.3 吸光度測定 在已揮干的對照品、供試品溶液中精密加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，殘渣溶解，再加0.8 mL高氯酸，混勻后移入10 mL比色管中，60 ℃水浴加熱10 min，取出，冰浴冷卻，精密加入5.0 mL冰乙酸，搖勻，在560 nm波長處測定吸光度。

2.4 正交試驗 在前期單因素試驗基礎上，并結合《保健食品注冊與備案管理辦法》中關于保健酒的酒精度數和食用量的規定，以松果菊苷+毛蕊花糖苷、紅景天苷、總皂苷量為評價指標，浸提時間(A)、基酒度數(B)、基酒倍數(C)為影響因素，采用L9(34)正交試驗優化提取工藝，計算綜合評分Y，公式為Y=(松果菊苷+毛蕊花糖苷總量/最高總量×權重系數+紅景天苷含量/最高含量×權重系數+總皂苷含量/最高含量×權重系數)×100，L9(34)正交試驗優化提取工藝，結果見表1。

表1 試驗設計與結果

2.5 權重系數確定

2.5.1 AHP法 根據復方中藥保健酒中君臣佐使的配伍，以及各指標成分對緩解體力疲勞、增強免疫力直接作用的強弱程度，采用 1～9 標度法[8-11]對3個影響因素進行兩兩比較以評判重要性，判斷標準見表2，最終將各指標成分作為權重指標予以量化，判斷優先矩陣表見表3。按照方根法計算各個指標的初始權重系數(Wi′)，算數平均法計算歸一化權重系數(Wi)，得到松果菊苷+毛蕊花糖苷總量、總皂苷、紅景天苷權重系數分別為0.625 0、0.238 5、0.136 5，再對其進行一致性檢驗，測得一致性指標CI為0.009，平均隨機一致性指標RI為0.58，一致性比率CR(CI/RI)為0.02<0.10，表明各指標的判斷矩陣排序滿足一致性要求，設計合理，權重系數有效。

表2 判斷矩陣標度定義

表3 指標成對比較的判斷矩陣及其權重系數

2.5.2 CRITIC法 CRITIC法[12-14]是一種客觀權重賦權法，它以2個基本概念為基礎，一是對比強度，以標準差的形式來表現；二是評價指標之間的沖突性，以指標之間的相關性為基礎，故該方法是基于評價指標的對比強度和指標之間的沖突性來綜合衡量指標的客觀權重，在考慮指標變異性大小的同時兼顧指標之間的相關性，完全利用數據自身的客觀屬性進行科學評價。本實驗將表1數據進行無量綱化處理，即指標成分=(實測值-最小值)/(最大值-最小值)，利用MATLAB 7.11(R2010b)軟件將標準化數據進行相關系數運算，得到3×3相關系數矩陣(Z)，通過公式Cj、Wj得到松果菊苷+毛蕊花糖苷、紅景天苷、總皂苷指標權重系數分別為0.290 4、0.260 4、0.449 3。具體如下。

2.5.3 AHP-CRITIC混合加權法 AHP法量化了評價指標兩兩比較判斷的優先信息，主觀評價了各指標的權重系數，可體現配方中各藥味君臣佐使的配伍原則；CRITIC法利用對比強度和沖突性來綜合客觀地評價指標成分的權重系數，故實驗將這2種評價方法相結合，兼顧主觀評價和客觀權衡，使得權重系數的確定更科學合理。計算公式為ω綜合=ωAHPωCRITIC/∑ωAHPωCRITIC[15]，其中ωAHP為通過AHP法確定的權重系數，ωCRITIC為通過CRITIC法確定的權重系數，測得松果菊苷+毛蕊花糖苷、紅景天苷、總皂苷權重系數分別為0.559 9、0.109 6、0.330 5。

2.5.4 綜合評價結果比較 分別采用AHP法、CRITIC法、AHP-CRITIC混合加權法對正交試驗結果進行綜合評價，結果見表4，可知3種賦權法所得綜合評分相差不大。利用MATLAB 7.11(R2010b)軟件對評分結果進行相關系數分析，測得AHP法與AHP-CRITIC法之間的相關系數為0.998 9，CRITIC法與AHP-CRITIC法之間的相關系數為0.987 2，AHP法與CRITIC法之間的相關系數為0.988 8，均有顯著差異(P<0.05)；對權重系數進行分析，測得AHP法與CRITIC法之間的相關系數為-0.174 7，無顯著差異(P>0.05)，表明AHP法和CRITIC法所展示的信息無疊加性，故AHP-CRITIC混合加權法計算權重系數時更科學合理。

表4 3種賦權方法綜合評分(分)

2.6 工藝確定 對AHP-CRITIC混合加權法所得綜合評分進行方差分析，結果見表5，可知因素C有顯著影響(P<0.05)，而B、C不顯著(P>0.05)。最終確定，最優工藝為A2B2C2，即浸提時間42 d，基酒度數60%，基酒倍數8倍。

表5 方差分析

2.7 驗證試驗 按“2.6”項下優化工藝進行3批驗證試驗，結果見表6。由此可知，各指標成分含量和綜合評分RSD均小于3%，表明該工藝穩定可行。

表6 驗證試驗結果(n=3)

3 討論

3.1 指標成分含量測定 本實驗在測定復方肉蓯蓉酒中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量時，參考2015年版《中國藥典》肉蓯蓉藥材項下含量測定方法，但發現30 min內色譜峰出峰不完全，故通過調整甲醇比例及梯度洗脫時間使上述2種成分的色譜峰均能在期間出峰，表示分離度符合藥典要求，陰性樣品無干擾，專屬性良好；在測定紅景天苷含量時對色譜條件進行篩選，發現采用2015年版《中國藥典》紅景天藥材項下含量測定方法、2003年版《保健食品檢驗與評價技術規范》紅景天苷測定方法時，陰性樣品均有干擾，分離度不理想，故參照相關文獻對紅景天苷進行改進，發現所得色譜條件適用于本品中紅景天苷含量的測定。再對柱溫、體積流量、儀器、色譜柱等進行考察，發現該方法耐用性良好，分離度大于1.5，拖尾因子大于0.95，陰性樣品無干擾。

3.2 指標成分權重確立 在綜合評價中，常用的權重系數確定方法為熵權法、層次分析法(AHP)、CRITIC法、標準離差法等，而本實驗涉及到AHP法、CRITIC法、AHP-CRITIC混合加權法。復方肉蓯蓉酒作為復方中藥保健酒，AHP法可充分體現其組方的君臣佐使配伍原則，但將各成分作為權重指標予以量化時，其判斷優先評價標度容易受到操作者主觀判斷的影響；CRITIC法利用評價指標的對比強度和沖突性來綜合衡量指標的客觀權重，但容易忽略產品中主要藥味、主要指標成分對產其功效的貢獻率。因此，本實驗采用AHP-CRITIC混合加權法對正交試驗結果進行分析，并進行3批驗證試驗，發現所得結果接近，表明該方法所優化的工藝穩定可靠，可為復方肉蓯蓉酒后續工業化生產及成品質量控制提供參考依據。